SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤

SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 实验

原理和操作步骤

实验原理：

SDS-PAGE 是对蛋白质进行量化， 比较及特性鉴定的一种经济、 快速、而且可重复的方法。 该法是依据混合蛋白的分子量不同来 进行分离的。

SDS 是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折

叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。 SDS 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。 在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后， 电荷因素可被忽略。 蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

试剂和器材：

试 剂 ： 1. 5x 样 品 缓 冲 液 （ 10ml ） :0.6ml 1mol/L Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%

的

甘油， 2ml 10% 的 SDS ， 0.5ml 巯基

乙醇， 1ml 1% 溴酚蓝， 0.9ml 蒸馏水。可在 4℃保存数周，或在 －20 ℃保存数月。

2. 凝胶贮液： 在通风橱中， 称取丙烯酰胺 30g ，甲叉双丙烯酰胺 0.8g ，加重蒸水溶解后， 定容到 100ml 。过滤后置棕色瓶中， 4℃ 保存，一般可放置 1个月。

3. pH8.9 分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加 1mol/L HCl 48ml ，

加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH8.9 ，定容至 100ml ， 4℃保存。

4. pH6.7 浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加 1mol/L HCl 48ml ，加重蒸水 80ml 使其溶解，调 pH6.7 ，定容至 100ml ， 4℃保存。

5. TEMED （四乙基乙二胺）原液

6.10% 过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）

7. pH8.3 Tris- 甘氨酸电极缓冲液： 称取 Tris 6.0g ，甘氨酸 28.8g ， 加蒸馏水约 900ml ，调 pH8.3 后，用蒸馏水定容至 1000ml 。置4℃

保存，临用前稀释 10 倍。

8. 考马斯亮蓝 G250 染色液：称 100mg 考马斯亮蓝 G250 ，溶于200ml 蒸馏水中， 慢慢加入 7.5ml 70% 的过氯酸， 最后补足水到

250ml ，搅拌 1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

实验操作

（一）样品制备

将蛋白质样品与 5X 样品缓冲液（20ul ＋ 5ul ）在一个 Eppendorf

管中混合。放入 100 ℃加热 5－ 10min ，取上清点样。

（二）分离胶及浓缩胶的制备 1 将玻璃板、样品梳、

Spacer 用

洗涤剂洗净，用 ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；

2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；

Spacer ，按照 Bio-Rad Mini

3 按如下体积配制 10％分离胶 8.0 ml ，混匀；

ddH2O 3.0 ml

1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml 30% Acr-Bis 2.8 ml 10% SDS 80 ul 10%AP 56 ul TEMED 6 ul

4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约 胶即可聚合；

20 min 后

5 按如下体积配制6％浓缩胶

3.0 ml ， 混 匀； ddH2O

1.0

mol/LTris-HCl

pH=6.8

30% Acr-Bis

2.0 ml

400 ul

600 ul

10% SDS

10% AP

TEMED

36ul

24ul 4ul

6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；

7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样

20 μl;

8 稳压 200V ，溴酚蓝刚跑出分离胶时， 停止电泳，约需 45 min ～

1hr.

9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色 1～ 2 hr ；加入脱色液，置于 80 rpm 脱色摇床上 ,每 20 min 更换一次脱色液（ 10 ml 冰乙酸； 45 ml 乙醇； 45 ml 蒸馏水）至完全脱净。