实验方案

一、实验材料 1. 试剂

1.1 八种中药提取物及分级相的制备：

1、 8种中药（马齿苋、金钱草、玉米须、刺五加、杭白菊、桑叶、淫羊藿、萆薢）

经挑选后热风干燥，用40%的乙醇溶液，以料液比1׃20，超声辅助提取80min，干燥，即得到中药粗提物。

将中药粗提物的水溶液，依次用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次。将乙酸乙酯相，正丁醇相及水相旋转蒸发至干粉。

供试样品的制备：取一定量的中药粗提物、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相物质溶于蒸馏水，定容至1 mg/mL 。

1.2 α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC3.2.1.20），对硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG） 均购于美国sigma公司。 KH2PO4-K2HPO4（pH6.8）缓冲液

1.3 阳性对照品：拜唐苹，规格50mg/片，中国北京拜耳医药保健有限公司

1.4 葡萄糖测定试剂盒：葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法，上海荣盛生物药业有限公司生产。

血清总抗氧化能力（T-AOC）、SOD、MDA和GSH-PX试剂盒（南京建成生物工程研究所） 2. 仪器

TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； RE-52AAA旋转蒸发器（上海嘉鹏科技有限公司）； 5424离心机：德国Eppendorf股份公司， Varioskan Flash酶标仪：Thermo公司， 全自动生化分析仪等。 3. 实验动物

ICR小鼠，雄性，由浙江中医药大学实验动物中心提供 二、实验方法 1、体外实验：

2mL测活体系KH2PO4-K2HPO4（pH6.8）缓冲液中含10μL20mmol/L的底物PNPG，再加入不同浓度的待测样品10μL，反应在37 ℃恒温进行，加入10μL约10U/mL的酶，启动反应，连续监测400nm光吸收变化，即测定在酶的作用下释放出硝基酚(PNP)的量。最初1分钟吸收值的变化直线的斜率（slope），用于计算反应的初速度。

将一定浓度的被测提取液样品加到测活系统中，再加入α-葡萄糖苷酶启动反应，测定酶的活性为Ai，未加入抑制剂的测活结果为A0。Ai/A0为剩余活性（R.A.），此值越低抑制能力越强。

酶活力（U/mL）=K*slope*1 mL/测活时加入的酶液体积mL

式中K为硝基酚含量对应的吸光值系数。

在不同的提取液加量下测定对α-葡萄糖苷酶的快结合抑制，以剩余活性对每毫升测活溶液中抑制剂的浓度作图。曲线上活性被抑制一半处得到半抑制浓度值（IC50）。此参数值越小抑制能力越强。在相同条件下测定阿卡波糖、格列美脲和罗格列酮钠的抑制能力作为阳性对照。每个试样浓度做3次平行，取平均值。

2、体内降糖研究

ICR小鼠适应性饲养3天后禁食（不禁水）8h，链尿佐菌素150mg/kg腹腔注射，注射容积0.1mL/10g，7天后禁食12h，剪尾取血测空腹血糖，根据血糖值随机分为4组，分别为模型组、阳性对照组（拜糖苹300mg/kg）、高剂量组（600mg/kg）、中剂量组（300 mg/kg）和低剂量组（150mg/kg），每组动物数10只。另取10小鼠作为正常组。每天定时灌胃给药，正常对照组和模型对照组每天灌胃（与给药组）等体积生理盐水，给药容积0.1mL/10g。 分组 剂量（mg/kg） 正常组 模型组 阳性对照 300 低剂量组 150 中剂量组 300 高剂量组 600 生理盐水 生理盐水 三、实验指标

1、体重：每天喂药前称每只小鼠的体重，并记录。

2、空腹血糖：连续给药8天后，禁食（不禁水）12h，末次给药1h后剪尾取血，离心分离血清，测空腹血糖。

3、糖耐量：隔日进行糖耐量试验，小鼠禁食（不禁水）12h，末次给药1h后测空腹血糖，再灌胃给予葡萄糖2g/kg，分别于给葡萄糖后30min、1h、2h剪尾取血，离心分离血清，测血糖值。（单糖不适合做糖耐量实验） 4、（自做）免疫器官质量：糖耐量取血后处死，取其胸腺、脾脏、胰腺、肝、肾，称质量。 5、血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C（可用公式计算）水平：糖耐量后取血，于3000-5000rpm离心10分钟，分离上清血清备用（-20℃保存待测），全自动生化分析仪。 6、（自做）血清总抗氧化能力：T-AOC试剂盒。 7、（自做）肝组织SOD活性、MDA含量和GSH-PX活性：取出肝脏后，置4℃生理盐水中洗净血液，滤纸吸干后称重。用pH7.4的PBS在冰浴条件下制成10%的组织匀浆。 四、实验数据

实验数据使用SPSS13.0及Excel软件处理。数据表示为Mean±SD，对小鼠体重等生化指标进行组间差异性分析。

如果甘油三酯小于4.5mmol/L，则VLDL等于甘油三酯值的1/5。因为总胆固醇是LDL-C、HDL-C和VLDL-C(极低密度脂蛋白胆固醇)的总和，所以LDL-胆固醇可按下面的Friedewald公式计算：

计量单位为旧制的毫克/分升：LDL-胆固醇＝总胆固醇－HDL-胆固醇－甘油三酯÷5。 计量单为毫摩尔/升，则为： LDL-胆固醇＝总胆固醇－HDL-胆固醇－甘油三醇÷2.2。 对于甘油三酯>4.5mmol/的患者，用这种方法计算LDL-C并不准确，需要用聚乙烯硫酸沉淀法来获得更精确的数值。（血清低密度脂蛋白胆固醇直接测定法与Friedewald公式计算法的对比分析。