细胞培养|细胞冻存技术原理

1. 细胞冻存是将细胞储存在低温环境中，减少细胞代谢，实现长期储存的一种技术。

2. 在大多数细胞系中，细胞会随着衰老和演化不断的积累改变，造成表型和基因型的“培养漂移”，在冻存过程中，适当的操作和合适的冻存条件可以减少细胞特性的改变或丢失，起到细胞保种的作用。因而，正确且成功的冻存对于细胞的长久应用起着非常重要的作用。

1. 当温度低至-70℃时，细胞内的酶活性全部停止，代谢活动停止，故实现长期保存的目的。

2. 随着温度降低，细胞内外的水分都会结晶，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，从而引起细胞死亡，特别是0~-20℃的阶段，冰晶呈针状，及其引发细胞损伤。在不加任何保护剂条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。

3. 常见的冷冻保护剂是甘油或二甲基亚砜（DMSO）。DMSO能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

保护剂的选择

1. 细胞冻存中， 一般使用DMSO 作为保护剂。在细胞冻存中， DMSO 使用的最终浓度一般是 5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查到。

2. 对特别敏感的细胞在冻存时需测试适用的冻存液。例如神经元细胞冻存时需选择无血清冻存液，避免复苏后分化。

为什么要进行细胞冻存

·有限细胞系形态及代谢活动维持

·珍贵细胞保种

·细胞株标准品制备

·脐带血干细胞、NK细胞冻存

细胞冻存的时期

1. 用来冻存的细胞一般选择在细胞对数生长期，汇合度约 90% 的时候，这时细胞生长状态好，细胞数量也多，并且在收获细胞前 24 小时换一次培养液。

2. 对培养物进行微生物污染物检测，特别是支原体，确保细胞没有任何的污染。在细胞的收集过程中，实验操作要尽可能的温和，避免细胞受损。

细胞冻存的速率

1. 细胞的 冷冻速率适控制在 让细胞有足够的时间脱水而又不被过度脱水导致细胞损害。对大多数细胞来说，每分钟降 1 至 3 ℃是合适的。

2. 梯度降温法：4℃-30 min，20℃- 2h，-80℃冰箱冷冻过夜，次日将冻存管转移到液氮罐中长期保存。

3. 细胞程序降温盒，将准备好的细胞冻存管放进冻存盒，直接在-80℃过夜后就可以转移至液氮罐中。

4.在转移存放位置的过程中一定要迅速，转移时建议将冻存管放在干冰中恒温，尽量避免转移过程因温度变化对细胞活力的影响。

冻存环境

1. 细胞也可以在-80℃冰箱保存几个月左右的时间。

2. 细胞长期保存温度是 -130 ℃或更低。

3. 液氮罐中气态层温度在 -140℃至 -180℃之间，细胞可保存在气态层或浸入液氮中， 如果可能要保存在气态层，因为这样可避免由于有液氮进入冻存管而在拿出细胞时引起爆炸(但是这样液氮罐内只能存储少量液氮，需要经常添加)。

HyCyte?一步冻存液

HyCyte?冻存液是一种即用型、无血清、无需程序降温的细胞“长期”冻存液，该产品配方使用已超过15年，原料均从日本进口，冻存品质与日本产品一致。

·安全：无血清，不含异种动物成份

·广谱：适合多种细胞类型

·高效：复苏后细胞保持高活性及快速增殖 能力，不影响细胞功能

·方便：即用型，无需额外配制，无需程序降温盒及稀释

一步冻存液使用流程

一步冻存液的作用机理:

细胞膜保护剂—可在细胞膜外瞬间形成一层保护膜，保护细胞不受细胞外冰晶的损害。

渗透性保护剂—可迅速渗透至细胞内部，防止细胞内部产生大量冰晶，同时可保护细胞器，减少其在低温下的损伤。

细胞沉降稳定剂—可平衡细胞沉降速度，防止细胞在冻存过程中聚集成团。