(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 106153796 A(43)申请公布日 2016.11.23
(21)申请号 201510181413.9(22)申请日 2015.04.17
(71)申请人 西藏卫信康医药股份有限公司
地址 851400 西藏自治区拉萨经济技术开
发区孵化园区1#厂房二层收缩缝以南201-1室(72)发明人 胡军 付国莉 刘烽 张勇 (51)Int.Cl.
G01N 30/88(2006.01)
权利要求书4页 说明书9页 附图2页
(54)发明名称
注射用12种复合维生素的含量分析检测方法
(57)摘要
本发明为注射用12种复合维生素的含量分
维析检测方法，对脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、
生素D3、消旋α-生育酚采用同一高效液相法条件进行检测，供试品溶液为制剂内容物经非极性有机溶剂提取后制备，检测波长为265±3nm，对水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇采用同一高效液相法条件进行检测，检测波长为210±3nm，对生物素和维生素B12进行高效液相法检测，检测波长为200-600nm，优选维生素B12检测波长为550±3nm，方法具有更好的适用性。CN 106153796 A CN 106153796 A
权 利 要 求 书
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1.一种注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，特征在于：对脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、维生素D3、消旋α-生育酚采用同一高效液相法条件进行检测，供试品溶液为制剂内容物经非极性有机溶剂提取后制备，检测波长为265±3nm，对水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇采用同一高效液相法条件进行检测，检测波长为210±3nm，对生物素、维生素B12进行高效液相法检测，检测波长为200-600nm。
2.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、维生素D3、消旋α-生育酚检测的供试品溶液制备方法，特征为取本品内容物，精密称定，用10％-75％的极性有机溶剂分次转移至分液漏斗中，精密加非极性溶剂，振摇，放置至上层澄清，精密移取上层澄清液，用氮气吹干后，精密加入极性溶剂使溶解，摇匀，作为供试品溶液，非极性溶剂选自正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、氯仿、乙醚，极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、无水乙醇、乙腈、异丙醇。
3.根据权利要求1和2任意所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、维生素D3、消旋α-生育酚检测方法，避光操作，包括：
a.色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以甲醇-乙醇(15∶25)为流动相A，以乙腈-水(60∶5)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
总流速为0.8-1.2ml/分钟，检测波长为265nm±3nm，维生素D3峰、消旋α-生育酚峰、维生素A棕榈酸酯峰之间的分离度均应符合中国药典的相关要求；
b.对照品溶液的制备 取维生素D3对照品、维生素A棕榈酸酯对照品、消旋α-生育酚对照品，精密称定，置量瓶中，加极性有机溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，极性有机溶剂选自甲醇、无水乙醇、乙腈、异丙醇；
供试品溶液的制备 取本品内容物，精密称定，用40％-75％的极性有机溶剂分次转移至分液漏斗中，精密加非极性溶剂，振摇，放置至上层澄清，精密移取上层澄清液，用氮气吹干后，精密加入极性溶剂使溶解，摇匀，作为供试品溶液，非极性溶剂选自正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、氯仿、乙醚，极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、无水乙醇、乙腈、异丙醇；
c.测定 精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
4.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇检测方法，避光操作，包括：
a.色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以0.005mol/L戊烷
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磺酸钠的0.1％磷酸溶液为流动相A，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液-乙腈(20∶80)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
总流速为0.8-1.2ml/分钟，检测波长为210nm±3nm，各峰之间的分离度均应符合要求；
b.对照品溶液的制备 取四水合辅羧酶对照品、核黄素磷酸钠对照品、维生素B6对照品、叶酸对照品、右泛醇对照品、维生素C对照品、烟酰胺对照品，溶解并稀释定容，摇匀，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本品内容物，精密称定，加水使溶解并稀释定容，作为供试品溶液；
c.测定 精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
5.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇检测方法，避光操作，包括：
a.色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液为流动相A，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的O.1％磷酸溶液-乙腈(20∶80)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
总流速为0.8-1.2ml/分钟，检测波长为210nm±3nm，各峰之间的分离度均应符合要求；
b.对照品溶液的制备 取四水合辅羧酶对照品、核黄素磷酸钠对照品、维生素B6对照品、叶酸对照品、右泛醇对照品、维生素C对照品、烟酰胺对照品，溶解并稀释定容，摇匀，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本品内容物，精密称定，加水使溶解并稀释定容，作为供试品溶
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液；
c.测定 精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
6.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其生物素、维生素B12检测方法，包括：
a.色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以0.0015mol/L己烷磺酸钠-甲醇(83∶17)(用磷酸溶液(1→10)调节pH值至2.65±0.05)为流动相，检测波长为210nm，生物素峰与维生素B12峰之间的分离度应符合要求；
b.对照品溶液的制备 取维生素B12对照品、生物素对照品，精密称定，溶解并用水稀释定容，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备 取本品内容物，精密称定，加水溶解定容，摇匀，作为供试品溶液；c.测定 精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
7.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其生物素检测方法，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以磷酸氢二钾缓冲液(精密称取磷酸氢二钾1.132g，加水溶解并稀释至3000ml，用磷酸溶液(1→10)调节pH至3.0)为流动相A，甲醇为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
总流速为0.8-1.5ml/分钟，检测波长为210nm±3nm，理论塔板数按生物素峰计算应不低于3000。
8.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其维生素B12
检测方法，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以磷酸盐缓冲液(精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠试液调节pH值为7.5)-乙腈(89∶11)为流动相A，以水-乙腈-磷酸(499∶499∶2)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
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权 利 要 求 书
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总流速为0.8-1.5ml/分钟，检测波长为550nm±3nm，理论塔板数按维生素B12峰计算应不低于2000。
9.根据权利要求1所述的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其维生素B12
检测方法，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以磷酸盐缓冲液(精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠试液调节pH值为7.5)-乙腈(89∶11)为流动相A，以水-乙腈-磷酸(499∶499∶2)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
总流速为0.8-1.5ml/分钟，检测波长为550nm±3nm，理论塔板数按维生素B12峰计算应不低于2000。
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说 明 书
注射用12种复合维生素的含量分析检测方法
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技术领域
[0001]
本发明涉及一种注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，属药物分析领域。
背景技术
胃肠外营养在疾病的治疗上发挥重要的支持作用，广泛用于如先天性消化道畸形、中重度营养不良、消化道疾病(严重腹泻、坏死性小肠结肠炎、短肠综合征早期、肠梗阻、肠瘘、坏死性胰腺炎)、不能正常摄食的重危新生儿、放化疗所致严重胃肠道反应、严重感染、较大的手术、创伤、烧伤等的治疗。维生素是维持人体生命活动必需的一类微量有机物质，一般不能在人体内经自身的同化作用合成，正常人体通过食物即可获得人体所需的维生素，烧伤、手术、严重创伤、感染等可能引起超高代谢等将导致人体营养不良，包括维生素的缺乏，患者对维生素需求增加，补充肠外维生素利于患者康复。[0003] 按溶解性质分，维生素可分为脂溶性维生素和水溶性维生素，脂溶性维生素主要为维生素A、维生素E、维生素K、维生素D及其它们的类似物，水溶性维生素主要为维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、叶酸、右泛醇、生物素、烟酰胺、维生素C及其它们的类似物。
[0004] 注射用12种复合维生素为含有水溶性维生素和脂溶性维生素(不含维生素K)的复合维生素制剂，维生素可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两类，含有维生素A棕榈酸酯(维生素A)、胆骨化醇(维生素D3)和消旋α-生育酚(维生素E)三种脂溶性维生素，并含有9种水溶性维生素：四水合硫胺焦磷酸酯(维生素B1)、核黄素磷酸钠(维生素B2)、盐酸吡多辛(维生素B6)、氰钴胺(维生素B12)、抗坏血酸(维生素C)、叶酸、右泛醇(泛酸)、D-生物素、烟酰胺，法国Clintec Parenteral公司从1999年开始在我国进口注射用12种
[0002]
复合维生素，商品名“施尼维他”，进口注册证号X19990399，2003年续签，进
口注册证号H20030052。目前施尼维他在我国已广泛应用于临床，规格为每支含：维生素A棕榈酸酯3500IU、维生素D3220IU、消旋α-生育酚10.2mg、维生素C 125mg、烟酰胺46mg、右泛醇16.15mg、维生素B65.5mg、核黄素磷酸钠5.67mg、四水合硫胺焦磷酸酯5.8mg、叶酸414μg、D-生物素69μg、维生素B126μg。[0005] 已有技术显示，维生素类成分理化性质复杂，溶解性质不同，多不稳定，多对光、热、氧、金属离子、酸度等敏感，其贮存条件多要求较严格，如叶酸对酸碱不稳定，维生素D要求避光、密封、充氮、冷处保存；维生素各成分之间也不稳定，如维生素B1、维生素B12相互作用会使含量降低，维生素B12可使维生素C含量降低，且维生素类制剂其维生素含量多微量，对复方维生素制剂的质量控制检测为该类制剂的难点之一。[0006] 脂溶性维生素注射液(含维生素A棕榈酸酯、维生素D2、维生素E和维生素K)和注射用水溶性维生素(含硝酸硫胺、核黄素磷酸钠、烟酰胺40mg、盐酸毗哆辛、泛酸钠、维生素C钠、生物素、叶酸和维生素B12)均在国家药品标准(药品标准二部第五册)有收载，文献也有一些维生素原料和制剂的检测方法，但由于注射用12种复合维生素含有水溶性维生素和脂溶性维生素为一体，且部分维生素存在形式不同，目前文献方法检测干扰较大，对
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说 明 书
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单个维生素检测效率较低，且对部分维生素的专属性和灵敏度较差。发明内容
本发明提供了一种一种注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，将部分维生素同时检测，提高了检测效率且具有较高的检测灵敏度。
[0008] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，特征在于对脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、维生素D3、消旋α-生育酚采用同一高效液相法条件进行检测，供试品溶液为制剂内容物经非极性有机溶剂提取后制备，检测波长为265±3nm，对水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇采用同一高效液相法条件进行检测，检测波长为210±3nm，对生物素、维生素B12进行高效液相法检测，检测波长为200-600nm。
[0009] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、维生素D3、消旋α-生育酚检测的供试品溶液制备方法，可以为取本品内容物，精密称定，用10％-75％的极性有机溶剂分次转移至分液漏斗中，精密加非极性溶剂，振摇，放置至上层澄清，精密移取上层澄清液，用氮气吹干后，精密加入极性溶剂使溶解，摇匀，作为供试品溶液，非极性溶剂选自正己烷、环己烷、石油醚、正庚烷、氯仿、乙醚，极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、无水乙醇、乙腈、异丙醇，非极性溶剂优选正己烷，极性溶剂乙醇、异丙醇。[0010] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其脂溶性成分维生素A棕榈酸酯、维生素D3、消旋α-生育酚检测方法，避光操作，包括：[0011] a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以甲醇-乙醇(15∶25)为流动相A，以乙腈-水(60∶5)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
[0007] [0012]
[0013]
总流速为0.8-1.2ml/分钟，检测波长为265nm±3nm，维生素D3峰、消旋α-生育酚峰、维生素A棕榈酸酯峰之间的分离度均应符合中国药典的相关要求。[0015] b.对照品溶液的制备取维生素D3对照品、维生素A棕榈酸酯对照品、消旋α-生育酚对照品，精密称定，置量瓶中，加极性有机溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，极性有机溶剂选自甲醇、无水乙醇、乙腈、异丙醇；[0016] 供试品溶液的制备取本品内容物，精密称定，用40％-75％的极性有机溶剂分次转移至分液漏斗中，精密加非极性溶剂，振摇，放置至上层澄清，精密移取上层澄清液，用氮气吹干后，精密加入极性溶剂使溶解，摇匀，作为供试品溶液，非极性溶剂选自正己烷、环己
[0014]
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烷、石油醚、正庚烷、氯仿、乙醚，极性有机溶剂选自甲醇、乙醇、无水乙醇、乙腈、异丙醇；[0017] c.测定精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
[0018] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇检测方法，避光操作，包括：[0019] a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液为流动相A，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液-乙腈(20∶80)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
[0020]
[0021] 总流速为0.8-1.2ml/分钟，检测波长为210nm±3nm，各峰之间的分离度均应符合
要求；
[0022]
b.对照品溶液的制备取四水合辅羧酶对照品、核黄素磷酸钠对照品、维生素B6对照品、叶酸对照品、右泛醇对照品、维生素C对照品、烟酰胺对照品，溶解并稀释定容，摇匀，作为对照品溶液；
[0023] 供试品溶液的制备取本品内容物，精密称定，加水使溶解并稀释定容，作为供试品溶液；
[0024] c.测定精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
[0025] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其水溶性成分四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇检测方法，避光操作，包括：[0026] a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液为流动相A，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液-乙腈(20∶80)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
[0027]
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[0028] 总流速为0.8-1.2ml/分钟，检测波长为210nm±3nm，各峰之间的分离度均应符合
要求；
b.对照品溶液的制备取四水合辅羧酶对照品、核黄素磷酸钠对照品、维生素B6对照品、叶酸对照品、右泛醇对照品、维生素C对照品、烟酰胺对照品，溶解并稀释定容，摇匀，作为对照品溶液；
[0030] 供试品溶液的制备取本品内容物，精密称定，加水使溶解并稀释定容，作为供试品溶液；
[0031] c.测定精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
[0032] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其生物素、维生素B12检测方法，包括：
[0033] a.色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以0.0015mol/L己烷磺酸钠-甲醇(83∶17)(用磷酸溶液(1→10)调节pH值至2.65±0.05)为流动相，检测波长为210nm，生物素峰与维生素B12峰之间的分离度应符合要求；[0034] b.对照品溶液的制备取维生素B12对照品、生物素对照品，精密称定，溶解并用水稀释定容，作为对照品溶液；
[0035] 供试品溶液的制备取本品内容物，精密称定，加水溶解定容，摇匀，作为供试品溶液；
[0036] c.测定精密量取对照品溶液与供试品溶液各5-50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。
[0037] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其生物素检测方法可以为单独检测，色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以磷酸氢二钾缓冲液(精密称取磷酸氢二钾1.132g，加水溶解并稀释至3000ml，用磷酸溶液(1→10)调节pH至3.0)为流动相A，甲醇为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
[0029] [0038]
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总流速为0.8-1.5ml/分钟，检测波长为210nm±3nm，理论塔板数按生物素峰计算应不低于3000。
[0040] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其维生素B12检测方法，其检测波长优选550550nm±3nm，优选550nm，如色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以磷酸盐缓冲液(精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠试液调节pH值为7.5)-乙腈(89∶11)为流动相A，以水-乙腈-磷酸(499∶499∶2)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
[0039] [0041]
总流速为0.8-1.5ml/分钟，检测波长为550nm±3nm，理论塔板数按维生素B12峰计算应不低于2000。
[0043] 本发明的注射用12种复合维生素的含量分析检测方法，其维生素B12检测方法，色谱条件可以为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温20-50℃，以磷酸盐缓冲液(精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠试液调节pH值为7.5)-乙腈(89∶11)为流动相A，以水-乙腈-磷酸(499∶499∶2)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱
[0042] [0044]
[0045]
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总流速为0.8-1.5ml/分钟，检测波长为550nm±3nm，理论塔板数按维生素B12峰计算应不低于2000。
[0046]
具体实施方式
[0047] 本发明所述的高效液相法条件色谱条件为优选的条件，如下述的实施例为优选的情况，具体可根据不同的高效液相色谱仪及色谱柱型号的不同而进行微调，如微调洗脱溶剂的比例±5％以内，微调梯度洗脱程序时间±5分钟以内和微调梯度洗脱流动相比例±5％以内，本发明的高效液相法条件色谱条件更大的调整(如大于±10％)视具体情况也能达到良好的检测目标，只是在检测时间、色谱峰的分离度、灵敏度方面可能不是较优选的方案和效率。[0048] 实施例1
维生素A棕榈酸酯、维生素D3与消旋α-生育酚照高效液相色谱法(中国药典
2010年版二部附录VD)测定。(避光操作)
[0050] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×250mm)，柱温40℃，以甲醇-乙醇(15∶25)为流动相A，以乙腈-水(60∶5)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱：
[0049] [0051]
总流速为1.0ml/min，检测波长为265nm，理论塔板数按维生素A棕榈酸酯峰计算，
应不低于4000，维生素D3峰与消旋α-生育酚峰以及维生素A棕榈酸酯峰与消旋α-生育酚峰之间的分离度均应符合要求。
[0053] 对照品溶液的制备取维生素D3对照品约5.5mg，精密称定，置100ml量瓶中，加无水乙醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为维生素D3对照品储备液；取维生素A棕榈酸酯对照品约21.0mg，精密称定，置25ml量瓶中，加无水乙醇适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为维生素A棕榈酸酯对照品储备液；精密量取维生素D3对照品储备液1ml与维生素A棕榈酸酯对照品储备液5ml，置50ml量瓶中，另取消旋α-生育酚对照品约20.4mg，精密称定，置上述同一量瓶
[0052]
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中，加乙腈适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。[0054] 样品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，研细，取细粉约一瓶的量，精密称定，用65％的乙醇50ml分次转移至250ml分液漏斗中，精密加正己烷25ml，振摇，提取，放置至上层澄清，精密移取上层澄清液10ml置于锥形瓶中，用氮气吹干后，精密加入乙腈10ml使溶解，摇匀，作为样品溶液。
[0055] 测定法精密量取对照品溶液与样品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。[0056] 典型图谱见图1，其中15.967min、20.911、37.476分别为维生素D3、消旋α-生育酚、维生素A棕榈酸酯色谱峰。[0057] 实施例2
[0058] 四水合辅羧酶、核黄素磷酸钠、维生素B6、维生素C、烟酰胺、叶酸、右泛醇照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。(避光操作)
[0059] 色谱条件与系统适用性试验用Inertsil 5μODS24.6×250mm色谱柱，柱温40℃，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液为流动相A，以0.005mol/L戊烷磺酸钠的0.1％磷酸溶液-乙腈(20∶80)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱：
[0060]
总流速为1.0ml/min，检测波长为210nm，理论塔板数按核黄素磷酸钠峰计算应不低于15000，各峰之间的分离度均应符合要求。
[0062] 对照品溶液的制备取四水合辅酸酶对照品约11.6mg、核黄素磷酸钠对照品约11.34mg、维生素B6对照品约11.0mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液A；取叶酸对照品约8.28mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水适量及氢氧化钠试液少许，振摇使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液B；取右泛醇对照品约16.16mg，精密称定，置10ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液C；精密量取对照品储备液A、B各1ml与对照品储备液C 2ml，置50ml量瓶中，另取维生素C对照品约25.0mg与烟酰胺对照品约9.2mg，精密称定，置上述同一量瓶中，加水适量振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。[0063] 样品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，研细，取细粉约一瓶的量，精密称定，至50ml容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液5ml，置25ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液。
[0064] 测定法精密量取对照品溶液与样品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱
[0061]
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说 明 书
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图；按外标法以峰面积计算，即得。[0065] 典型图谱见图2，其中标示为1、2、3、4、5、6、7色谱峰分别为四水合辅羧酶、维生素C、烟酰胺、维生素B6、右泛醇、核黄素磷酸钠、叶酸色谱峰。[0066] 实施例3
[0067] 生物素照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。[0068] 色谱条件与系统适用性试验用Inertsil 5μODS24.6×250mm色谱柱，柱温40℃，以磷酸氢二钾缓冲液(精密称取磷酸氢二钾1.132g，加水溶解并稀释至3000ml，用磷酸溶液(1→10)调节pH至3.00±0.02)为流动相A，甲醇为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱。
[0069]
[0070] 总流速为1.2ml/min，检测波长为210nm，理论塔板数按生物素峰计算应不低于
1800。
对照品溶液的制备取生物素对照品约17.25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水
适量及氢氧化钠试液少许，振摇使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2ml于50ml量瓶中，加水适量稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。[0072] 样品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，研细，取细粉约一瓶的量，精密称定，精密加水5ml，振摇溶解，作为样品溶液。
[0073] 测定法精密量取对照品溶液与样品溶液各50μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。[0074] 典型图谱见图3，其中标示为56.911分钟色谱峰为生物素色谱峰。[0075] 实施例4
[0076] 维生素B12照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)测定。
[0077] 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×250mm)，柱温40℃，以磷酸盐缓冲液(精密称取磷酸氢二钾0.87g，磷酸二氢钾0.41g，用水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠试液调节pH值为7.5)-乙腈(89∶11)为流动相A，以水-乙腈-磷酸(499∶499∶2)为流动相B，按下列程序进行梯度洗脱：
[0071] [0078]
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CN 106153796 A
说 明 书
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总流速为1.2ml/min，检测波长为550nm。理论塔板数按维生素B12峰计算应不低于1800。
[0080] 对照品溶液的制备取维生素B12对照品约15mg，精密称定，置250ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解并用水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液2ml于100ml量瓶中，加水适量稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0081] 样品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，研细，取细粉约一瓶的量，精密称定，精密加水5ml，振摇溶解，作为样品溶液。
[0079]
测定法精密量取对照品溶液与样品溶液各100μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。[0083] 典型图谱见图4，其中标示为8.110分钟色谱峰为维生素B12色谱峰。
[0082]
附图说明
[0084] 图1是本发明实施例1样品溶液典型图谱。[0085] 图2是本发明实施例2样品溶液典型图谱。[0086] 图3是本发明实施例3样品溶液典型图谱。[0087] 图4是本发明实施例4样品溶液典型图谱。
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说 明 书 附 图
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图1
图2
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说 明 书 附 图
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图3
图4
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