制备过程
背景：用生物可降解和生物相容性聚合物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物制备纳米粒是药物传递系统中研究最深入的共聚物。该研究的目标是充分探究PLGA纳米粒药物传递系统在商业剂型中的发展。我们的目的是比较纳米粒制造过程中不同的制备参数的影响。
方法：载多塔赛西PLGA纳米粒通过单一乳液技术和溶剂蒸发来进行比较。纳米粒用各种技术进行探究，包括扫描电子显微镜对其表面形态，动态光散射对其尺寸和zeta电位，X-射线光电子能谱对其表面化学和高效液相色谱对药物体外释放动力学的研究。为了得到更小的纳米粒，采用0.2%聚乙烯醇，0.03%D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸钠（TPGS），2%泊洛沙姆188，130瓦功率超声五分钟，磁力搅拌蒸发，和每分钟8000转的离心条件。为了提高纳米粒的封装效率，不同的条件效率也不同，即，2-5分钟的超声时间，70-120瓦功率，和5-25mg的载药量。
结果：选择130瓦功率下超声5分钟，10mg载药量。在这种条件下，纳米粒达到90%的封装效率。药代动力学显示，包含泊洛沙姆188，TPGS或者聚乙烯醇的纳米粒在28天内释放量分比为20.83%，40.07%，和51.5%。TPGS和泊洛沙姆比聚乙烯醇的释放动力学要小。据预测，根据X-射线光电子能谱发现有药物残留在表面。
结论：我们的研究显示表面活性剂的选择对控制多西他赛的释放非常重要。 关键词：多西他赛、纳米粒、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、不同的剂型、超声、封装效率。
简介
多西他赛是紫杉醇家族中的一个抗癌剂。紫杉醇类似物多西他赛通过从欧洲紫衫中提取的10-脱乙酰基果浆赤霉素III半合成得到的。多西他赛联合其他化疗药物在治疗乳腺癌、胰腺癌、胃癌和膀胱通路上皮癌方面显示很高的治疗效果。多西他赛水溶性低，临床上唯一使用的剂型是40mg/mL包含聚山梨酯80的高浓度溶液。这种赋形剂与一些过敏反应和其与普通聚氯乙烯经脉给药组不相容。为
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了消除聚山梨酯80为基础的赋形剂和提高药物溶解性，已经提出替代剂型，包括脂质体和环糊精。
纳米粒的聚合物基体必须符合多重要求，如生物相容性和生物可降解性，机械强度，易于加工。大家熟知的控释的生物可降解性材料是聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。许多出版物已经介绍了用PLGA制备纳米颗粒和配方变量的研究，包括PLGA的分子量，冻干剂，表面活性剂。因此，我们研究了用PLGA通过溶剂蒸发方法制备多西他赛来持续注射的配方。
乳液的形成是制备纳米粒最重要的一步，因为乳滴的大小与最终纳米粒的大小直接相关。这种乳液是通过含有多西他赛的有机相和包含表面表面活性剂或稳定剂的水相混合制备的，可以用外部能量将其分散成小液滴，通过有机溶剂的蒸发，纳米小液滴可以生成纳米颗粒。
在该研究中，我们专注于用PLGA制备多西他赛纳米颗粒的细节。为了获得更小的颗粒和更窄的粒径分布，我们根据乳化和蒸发条件改变了一些重要的参数。首要目的是确定以PLGA制备多西他赛纳米颗粒的最佳制备条件。
材料和方法
材料： 有游离羧基的PLGA（50：50 Resomer RG 502H）是从Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Germany)获得的。多西他赛是SamyangGenex Corporation (Daejeon, Korea)赠送的。聚乙烯醇是从Sigma-Aldrich (Steinheim, Switzerland)购买的，87-89%的水解，分子量为146000-186000。泊洛沙姆188从BASF (Ludwigshafen, Germany)购得。D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸钠（TPGS）和蔗糖从Sigma Aldrich购得。所有其它化学试剂是分析级或试剂级商品，使用时无需进一步纯化。
纳米颗粒制备：包含多西他赛的纳米颗粒是用单一乳化技术和溶剂蒸发的方法制备的。简要地说，多西他赛溶解于2mL二氯甲烷中，再向该溶液中加入100mgPLGA。油相在冰浴条件下用探头超声波破碎仪100瓦（VCX 130 Sonic and Mateerials，Newtown，CT）乳化2分钟。得到的油性溶液在冰浴条件下超声10分钟，进一步乳化成40mL含有0.2%聚乙烯醇的水性溶液。，乳化后，水包油型乳液磁力搅拌8小时，以蒸发掉有机溶剂。得到的纳米颗粒以8000转每分钟分离心20分钟分离。最后，纳米颗粒用蒸馏水洗涤除去残留的表面活性剂然后在
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蔗糖存在条件下冻干。我们对流体粒子大小和药物封装效率百分比的各种处理参数进行了研究。处理参数包括水相中表面活性剂浓度和类型，初始载药量，超声时间和功率。除另外说明，所有实验是在其他变量不变的条件下仅改变一个变量条件下进行的。
多西他赛评价: 包含多西他赛的冻干纳米颗粒称重后溶解于二氯甲烷中。涡流15分钟后，二氯甲烷在氮气条件下挥发。产率、载药量、封装效率按如下方法计算：
产率（%）=颗粒重量/含聚合物的药物重量×100 载药量（%）=颗粒中药物重量/颗粒重量×100 封装效率（%）=颗粒中药物重量/给药重量×100
颗粒大小，zeta电位和表面张力测量: 纳米颗粒的大小的分析用动态光散射分析仪（ELS-8000，Otasuka Electaxel，Tokyo，Japan）进行分析。含有多西他赛的纳米颗粒加入到样品分散单元并进行超声，以减弱颗粒间的相互作用。遮蔽范围维持在2%-50%。用仪器测量样品30次可得到平均粒径。为了测量纳米颗粒的zeta电位，制备含有多西他赛的水性稀释悬浮液并超声一分钟。根据表面活性剂的浓度，检查含多西他赛的纳米颗粒的表面张力（Sigma 703D, Attension/Biolin Scientific, Espoo, Finland）。
扫描电子显微镜: 扫描电子显微镜用来验证颗粒形状和大小的均匀性。冻干纳米颗粒洒落在双层碳带上。与铂和混合物在真空下包衣45秒，并用FE-SEM（JEOL JSM7500,
Thermo Scientific）在5千瓦条件下进行形态学检查。
红外光谱和X-射线光电子能谱: 含多西他赛纳米颗粒表面结构特征用傅里叶变换红外光谱（FTIR, Nicolet 380, Thermo Scientific）在其固态条件下测定。纳米颗粒样品在红外光谱的扫描范围是400-4000cm-1.包含多西他赛的纳米颗粒的表面化学用X-射线光电子能谱检查（Multilab 2000, Thermo Scientific），测得的光谱用80eV传递能量，结合能量范围从0-1200eV。用制造商提供的软件进行曲线拟合。
载多西他赛的纳米颗粒体外释放曲线: 对包含多西他赛的纳米颗粒的多西他赛释放进行一式三份的研究，在室温下进行，用半透膜（molecular weight cut off
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10,000 Da, MEMBRA-CEL, Chicago, IL）分离供体和受体介质。受体介质填充100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲液，以保证溶解度。相当于300µg的大量纳米颗粒分散在供体介质中（5mL），在定义好的时间点将1mL的样品从吸收介质中撤回，并用等体积的新鲜介质替代。
统计分析: 学生的t检验作为对照组。P值小于0.05认为有统计学意义。
结果与讨论
载多西他赛的PLGA纳米颗粒直径的影响因素: 在制备的各步骤中，对影响载多西他赛纳米颗粒的平均粒径的变量进行了研究。这些变量包括有机溶剂，聚乙烯醇的浓度，TPGS，和水相中的泊洛沙姆188，超声功率和时间，以及离心速度。
不同有机溶剂和表面活性剂的影响: 乳液的形成是制备纳米颗粒最重要的一步，因为乳滴的大小与最终的纳米颗粒的大小直接相关。这种乳液是用包含聚合物的有机层和包含表面活性剂或稳定剂的水相混合制得，运用外部能量将其破碎为小液滴，这些纳米液滴在有机溶剂挥发后形成纳米颗粒。
首先，我们确定表面活性剂，即聚乙烯醇，TPGS，或泊洛沙姆188在水相中的最佳浓度。在标准条件下保持其他参数的恒定，改变表面活性剂浓度来确定浓度对颗粒大小的影响。图1中，显示了水相中各表面活性剂的浓度下的纳米颗粒大小和表面张力。水相中表面活性剂浓度的变化为：聚乙烯醇0.1%-4%，TPGS 0.015%-1%，或者泊洛沙姆188 0.1%-4%；其它所有制备参数，包括超声时间和药物浓度保持恒定。聚乙烯醇浓度的增加引起纳米颗粒大小的显著减少，减少量为0.2%，这与表面张力一致。这与低界面张力一致，界面张力减小从而颗粒大小也减小。聚乙烯醇浓度增加0.2%颗粒大小也增加。。其他研究者已经报道，增加提高聚乙烯醇浓度可以增加外部水相的粘度，导致净剪应力的下降，颗粒大小也相应增加。泊洛沙姆188浓度为4%时颗粒大小为44.3± 0.7 µm，泊洛沙姆188浓度为2%时颗粒大小为46.5± 1.2 µm.然而，当制备纳米颗粒时采用TPGS，颗粒大小和表面张力没有相关性。
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图1 含不同溶剂和表面活性剂的剂型的颗粒大小和表面张力
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在前面的试验中，事先确定表面活性剂聚乙烯醇，TPGS，和泊洛沙姆188的浓度分别为为2%，0.03% 和0.2%。随后，使用三种有机溶剂，包括二氯甲烷，氯仿和乙酸乙酯。用氯仿时，泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇制备的纳米颗粒的大小分别为290.2 nm，292.8 nm和265.5 nm，zeta电位分别为-19.27mV,-3.29 mV和-16.6 mV。用氯仿时，泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇制备的纳米颗粒的大小分别为340.5 nm，531.0 nm和274.4 nm，zeta电位分别为18.94 mV，-20.39 mV和-16.44 mV。用乙酸乙酯时，泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇制备的纳米颗粒的大小分别为438.8 nm，1044.2 nm和393.6 nm，zeta电位分别为-20.75 mV，-14.52 mV和-19.2 mV（图2）.根据以上结果，二氯甲烷作为有机溶剂和0.2%聚乙烯醇作为水性溶剂时得到最小的颗粒大小。另据报道，表面活性剂的作用是通过阻止凝聚而使乳化液滴稳定。为达到高效稳定的作用，表面活性剂分子必须覆盖在有机溶剂和水相界面的所有液滴。
图2 含不同溶剂和表面活性剂的剂型的颗粒大小和zeta电位
超声功率和时间的影响: 最小的纳米颗粒是在130瓦下超声5分钟得到的（表1）。因此，超声功率可能会减小纳米颗粒的大小，可能是因为声纳能量可以通过乳化和减小平均颗粒粒径来增加能量的释放。 表1 超声功率和时间对纳米颗粒特征的影响
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蒸发方法和时间的影响: 除去有机溶剂的方法对纳米颗粒的大小有非常重要的影响。我们用旋转蒸发仪和磁力搅拌得到了亚微纳米颗粒，但是在氮气和减压条件下不可能得到亚微大小的颗粒。表2中显示氮气有最快的有机溶剂的蒸发率，但是也会导致得到的颗粒比磁力搅拌下得到的颗粒大。这表明，有机溶剂去除的蒸发率影响颗粒大小。图3显示，在制备纳米颗粒的过程中，不同磁力搅拌时间对去除有机溶剂的影响。在搅拌时间分别为2,4,6小时条件下，纳米颗粒成聚集状态并呈球形。因此，我们总结，在磁力搅拌下，至少需要蒸发8小时来去除有机溶剂。
图3 不同磁力搅拌时间对去除有机溶剂的影响(A)2小时 (B)4小时 (C)6小时 (D)8小时
表2 搅拌时间对纳米颗粒大小的影响
离心速度的影响: 图4显示纳米颗粒在不同离心速度下的制备。在每分钟8000
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和10000转离心速度下，纳米颗粒呈球形，而且不聚集，但是在每分钟13000和15000转离心速度下会发生聚集。每分钟8000和10000转离心速度相比较，在每分钟10000转速度下大的纳米颗粒伴有小颗粒。
图4 不同转速下纳米颗粒大小的电子扫描显微镜图片。(A)8000 (B)10000（C）13000 (D)15000
载多西他赛纳米颗粒封装效率的影响因素:在载多西他赛PLGA纳米颗粒制备过程中，对影响封装效率的影响因素进行了研究。这些因素包括按顺序混合的有机相，药物用量，超声功率和时间，有机溶剂类型和水相中聚乙烯醇，TPGS或者泊洛沙姆188的浓度。
有机相混合顺序的影响: 为了优化载多西他赛PLGA纳米颗粒的用量，我们对制备这些颗粒的不同试验条件进行了评价。我们将有机相的制备对颗粒的影响进行了评价，对多西他赛封装效率的影响列于表3中。纳米颗粒中，有机相按照F4方法制备，封装效率为78.78%，除此之外，初始载药量的封装效率仅为3.64%-10.03%。因此，F4被选为有机相制备的方法。这可能是由于多西他赛和聚合物都溶解时发生的不同相互作用，因此导致不同的封装效率。F4和其他制备方法也有不同聚合物浓度和混合方法，并且药物和聚合物之间也会发生相互作用。
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表3 多西他赛和PLGA混合顺序对封装效率的影响
药物用量的影响: 表4显示初始药量对封装效率的影响。当初始载药量为25mg时，随着初始药量的增加，药物封装效率先增加后减小。多西他赛药量为10mg时，有最大封装效率。在我们的试验中，在制剂过程中初始药量增加时，有机相中的药物浓度也增加。这表明更多的药物分子可以和PLGA分子相互作用，导致封装多西他赛量的增加。然而，封装量的增加与制剂中药量的增加不成比例，所以封装效率下降。
表4 药物用量对纳米颗粒特性的影响
超声影响程度: 表1表明不同超声参数对封装效率的影响。超声时间为5分钟和10分钟时，封装效率随着超声的功率的增加而增加。然而，时间为2分钟时，在此过程中释放更高的能量将导致封装效率的下降。这些结果表明，超声时间为5分钟和10分钟时，增大超声功率会增加封装效率。超声时间2分钟时，超声功率高于70瓦则太高而无法制备稳定的纳米混悬剂。
不同有机溶剂和表面活性剂的影响: 图5显示多西他赛的封装效率。使用氯仿时，多西他赛的封装效率显著下降。用TPGS制备相同的溶剂则导致最低的封装
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效率，使用聚乙烯醇得到最高的封装效率。
图5 使用不同有机溶剂和表面活性剂的剂型的封装效率和百分率
X-射线光电子能谱和红外光谱分析: X-射线光电子能谱是是一种定量技术，通过测量聚合物基质5-10 nm深度下电子和原子的结合能，得到基本的和平均化的化学组成。X-射线光电子能谱C1s对载多西他赛纳米颗粒表面进行封装，并且其成分被检测，结果展示与表5中。首先，在物理混合物的纳米颗粒中有淡信号的检测，这可以表明多西他赛在表面上。氮信号只是在多西他赛中被发现就是多西他赛存在于纳米颗粒表面的证据。 表5 表面化学的X-射线电子能光谱
多西他赛纳米颗粒的红外光谱显示在图6中。多西他赛主要的峰在1725 cm-1附近，PLGA显示特征的羧酸羰基峰在1750 cm-1附近。物理混合的红外光谱检测显示了PLGA和多西他赛的主峰。然而，在多西他赛纳米颗粒的红外光谱中，多西他赛的主峰非常低。这显示PLGA和多西他赛间的相互作用，羧酸在PLGA和多西他赛中酯基相互作用，酯基的吸收频率相应地降低。
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图6 表面化学的傅立叶变换红外光谱
在不同表面活性剂和有机溶剂条件下的体外释放: 图7A显示三种多西他赛纳米颗粒体外释放动力学。对所有的表面活性剂，都能够观察到初始的爆发释放。之后，多西他赛以恒定速率释放。很明显，由TPGS和泊洛沙姆188制得的纳米颗粒中多西他赛的释放速率要小于由聚乙烯醇制得的纳米颗粒的释放速度。药物的扩散，腐蚀，聚合物的膨胀，和聚合物基体的降解是药物释放的主要机制。由于PLGA的降解速率缓慢，多西他赛从纳米颗粒中主要依靠药物扩散和基体腐蚀。在这种情况下，大小，硬度，和纳米粒孔隙度显著影响释放特性。扫描电镜观察结果表明，所有类型的纳米颗粒都有光滑的表面，这有利于药物缓慢释放。而且，大小也是决定释放速率的重要因素，且用TPGS，聚乙烯醇和泊洛沙姆188 制得的纳米颗粒有相似的大小。TPGS和泊洛沙姆188体积较大，且有较大的表面积。因此，用TPGS乳化纳米颗粒在体外释放的速率小于聚乙烯醇，因为他有不同的表面特征。图7B显示了三种类型的载多西他赛纳米颗粒体外释放动力学常数。对所有所有有机溶剂，都能够观察到初始的爆发释放。之后，多西他赛以恒定的速率释放。乙酸乙酯的平均释放速率低于二氯甲烷和氯仿。然而，三种有机溶剂并未影响慢速释放动力学常数。
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图7 不同表面活性剂（A）和有机溶剂(B)下的体外释放动力学常数
总结
影响微粒大小和药物封装效率的各种工艺参数均被系统地研究了。可以得出结论，处方变量可以进一步提高，以加强疏水性药物用水包油的方法封装入PLGA纳米颗粒。在最佳参数条件下，可以获得最小的球形颗粒。纳米颗粒的大小可以通过修改不同工艺参数来获得，如表面活性剂的类型和浓度，超声参数，封装参数，离心参数。为了获得更小的颗粒，可以选择0.2%聚乙烯醇，0.03%TPGS或者2%泊洛沙姆188，五分钟超声时间，130瓦超声功率，磁力搅拌蒸发，离心速率8000转/分钟。药物封装效率依靠不同制剂因素，如混合顺序，超声时间和功率，载药量，表面活性剂类型和有机溶剂。为了提高纳米颗粒封装效率，各种因素的变化范围是超声时间为2-5分钟，超声功率为70-130瓦，载药量为5-25 mg。最终，选择5分钟的超声时间，130瓦超声功率，10 mg载药量。在28天内，用不同类型的有机溶剂和表面活性剂，多西他赛显示从纳米颗粒中不同的释放速率。用泊洛沙姆188，TPGS和聚乙烯醇的纳米颗粒28天内多西他赛释放动力学常数分别为20.83%，40.07%和51.5%。比较使用不同的表面活性剂，TPGS和泊
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洛沙姆188比聚乙烯醇有更小的释放动力学常数。X-射线光电子能谱证明仍有残留药物在颗粒表面。该研究证实不同因素影响平均颗粒直径，封装效率和释放动力学常数。
致谢
该工作由重点研究中心计划（2009-0093815）和基础科学研究计划（2009-0067380）通过国家教育，科学和技术部的国家研究基金支持。
声明
作者在这项工作中没有利益冲突。
参考文献（略）。
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