实验三 微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价

一、概述

由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降

解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。

微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。

琼脂扩散法，亦称管碟法。系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

二、基本设备、用具和试验材料 1. 基本设备

(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。

(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。

(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。

2.用具

（1） 玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。新购的双碟应按上述要求进行检查。检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一

致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。

(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。

(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。

(4) 小钢管放置器：四孔，一台。 (5) 游标卡尺：精密度0.02mm。

(6) 滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。

3. 试验材料

(1) 培养基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混合，调节pH使其值比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，在115℃灭菌30分钟。

(2) 营养琼脂培养基：取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混合，调节pH使比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.2-7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。

(3) 磷酸盐缓冲液（pH7.8）：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加蒸馏水使成1000ml，在115℃灭菌30分钟。

(4) 试验用菌种：短小芽孢杆菌(CMCC(B)63 202).

短小芽孢杆菌菌悬液的制备和保存：取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml 三角瓶中，在35-37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得，置5℃冰箱中保存，可使用6个月。

4. 双碟的制备：取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I 20ml,使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培

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养基适量加热融化后，放冷至50-60℃，加入菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。

三、二剂量检定法

取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。在35-37℃条件下培养14-16小时后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。

四、硫酸庆大霉素的效价测定：

1. 标准品溶液的配制：精密称取硫酸庆大霉素标准品适量，加乙醇溶解后，用灭菌水制成每1ml中含1000单位的溶液，作为贮备液，置5℃以下的冰箱中保存，可使用7日。将贮备液加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释，使标准品高剂量溶液和低剂量溶液每ml中分别含硫酸庆大霉素10U和5U。

2. 供试品溶液的配制：取硫酸庆大霉素肠溶片4片，研细，用乙醇适量（硫酸庆大霉素约0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸庆大霉素溶解，并用水稀释成每1ml中约含1000单位的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，按（1）法 同法配制，使供试品高剂量溶液和低剂量溶液按标示量计算每ml中含硫酸庆大霉素分别为10U和5U。

3. 测定法：按二剂量检定法测定效价，计算出供试品中含硫酸庆大霉素相当于标示量的百分数。

附录：生物检定统计法中的（2.2）法

抗生素微生物检定法是以微生物为工具，不可避免地存在着较大的生物差异性，

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因此，必须借助于生物统计方法来减少生物差异对检定结果的影响，使结果达到一定的精确度。英、美、日等国家药典附录中都详细地制定了生物检定方法的实验设计和统计分析，并根据生物统计的要求规定了各个品种的误差范围。中国药典从1985年版起增加了生物检定法的实验设计和可靠性测验及误差估计等内容，这对判断检验质量及促使检验方法的改进等方面都具有重要意义。

1.可靠性测验

抗生素微生物检定法按照观察的方法和生物反应的类型属量反应，即观察每一反应本身所表现的程度，可以用量来表示。实验设计采用供试品（T）和已知效价的标准品（S）对比试验的平行线原理。由于平行线测定的计算原理是在一定剂量范围内T和S的对数剂量与反应或反应的特定函数呈直线关系以及在T和S两条直线互相平行（当T和S的活性组分基本相同时）的基础上，因此，可靠性测验就是运用统计方法来验证实验结果是否符合量反应的平行线设计原理，是否显著偏离了直线性和平行性，以便评价实验结果的可靠性。对不是显著偏离平行偏离直线（在一定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。

(1)可靠性测验的统计方法

抗生素微生物检定法的可靠性测验采用F测验，即实验结果的方差分析。方差分析为测验多组均数之间的差别是否显著。通过统计运算求得试品间、回归、偏离平行、剂间及碟间项的方差，并以统计得的以上各项方差和误差项方差（S）的比值称F值（各项F值=程度。

将实验结果求得的F值，按相应各项的自由度及误差项的自由度查F值表来判断实验结果求得的F值是大于还是小于F值表上Ff1f20.05和Ff1f20.01的F值。

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各该项方差）作为指标来观察其差别的显著性

误差项方差（S)

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若大于Ff1f20.05的F值，则P<0.05,表示差别有显著意义。 若大于Ff1f20.01的F值，则P<0.01,表示差别有非常显著意义。 若小于Ff1f20.05的F值，则P>0.05,表示差别无显著意义。

P称概率，即某一事件在一定条件下可能发生的机会，P就是机会的定量表现形式，用数量的形式来反映出事情必然性的规律，它是生物统计的基础，一般在统计中评定实验结果的可靠程度以P表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的把握，P=0.01，即表示可靠性有99%的把握。

可靠性测验一般分为下述两个步骤：

①实验结果的方差分析：从实验数据的总变异差方和中分出剂间变异和碟间变异的差方和后，即为误差项的差方和，其方差以S2表示。

首先按剂量组将各反应值y（抑菌圈的直径）列成方阵见表1。

表1 实验结果 剂 量 组

(1)

1 2 3

y1(1) y2(1) y3(1)

(2) y1(2) y2(2) y3(2)

(3) y1(3) y2(3) y3(3)

… … … …

（K） y1(k) y2(k) y3(k)

总 和 Σym Σy1 Σy2 Σy3

总和平方 [Σym]2 [Σy1]2 [Σy2]2 [Σy3]2

双碟数



m 总 和 Σy(k)



ym(1) Σy(1)



ym(2) Σy(2)



ym(3) Σy(3)



… …



ym(k) Σy(k)



Σym Σy



[Σym]2 总 和 Σ[Σym]2

总和平方 [Σy(1)]2 [Σy(2)]2 [Σy(3)]2 [Σy(k)]2

… [Σy(k)]2

总 和 Σ[Σy(k)]2

y2的总和 Σy2

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表1中，K为S和T的剂量组数，m为各组内y的个数（即双碟数），各组的m应相等，n为反应的总个数，n=m×k。

各项变异的差方和及自由度（f）的计算

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(y)

差方和（总）=Σy2 —

n

f(总)=n — 1

(y)2

式中 =校正数

n

差方和（剂间）=

[y(k)]2m— 校正数

f(剂间)=K—1 差方和（碟间）=

[y(m)]2k— 校正数

f(碟间)=m — 1

差方和（误差）=差方和（总）—差方和（剂间）—差方和（碟间） f(误差)=f(总)—f(剂间)—f(碟间)=（k—1）（m—1） 方差=

该项差方和

该项自由度

S2=

差方和误差f误差或S2=

Kmy2K[y(k)]2m[ym]2[y]2Km(K1)(m1)

②剂间变异的分析：剂间变异的显著性测验主要包括S和T试品间、回归、平

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行性及直线性等变异内容。

各项变异的差方和及自由度（f）按表2二剂量法和表3三剂量法可靠性测验正交多项系数表计算。

表2 二剂量法可靠性测验正交多项系数表

变异来源

S1

S2

Σy(k)

T1

T2

差 方 和

自 由 度

正交多项系数（Ci）

试 品 间

回 归 偏离平行

表中正交多项系数用Ci表示，Σy（k）为各剂量组反应值之和。 各项变异的差方和=

{[Ciy(k)]}2mCi2-1 -1 1 1

{[Ciy(k)]}2mCi2{[Ciy(k)]}2mCi2{[Ciy(k)]}2mCi2

1

-1 1 -1 1

1

1 -1 -1 1

1

，除以该项的自由度即等于方差。以各变

异项的方差与误差项的方差（S2）的比值作为指标，进行F测验，以判断各项变异来源差异是否有显著意义。 （2）可靠性测验结果分析

①试品间：验证标准品（S）和供试品（T）的结果是否有差别，如P<0.05，即差别显著，就表明了T的效价估计得不够正确所致。由于S和T之间差别大，将影响整个实验误差，因此，实验时对T的效价的估计应尽量接近真实效价，使该项统计得的P>0.05，即表示差别无显著意义。

②回归：验证S和T两条对数剂量反应直线是否偏离直线性，因实验设计采用

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的剂量间距是等比级数，故反应应随剂量的增加而有规律的增加，若各反应点均匀的分布在一条直线上，就表明实验的直线性好，当该项统计得的P<0.01时，就证实有非常显著的意义。

③偏离平行：验证S和T两条对数剂量反应直线是否偏离平行性。按照平行线的设计原理，实验中所得的S和T 两条直线应互相平行，若不平行，则不能按照平行线原理计算公式来计算效价。如该项统计得的P>0.05，即证明偏离平行不显著，从而说明S和T两条直线互相平行。

⑤剂间：二剂量法和三剂量法，各有二个剂量和三个剂量，不同剂量所致的反应应有明显的差别，如无差别则说明剂量反应不在直线范围内，应重新调整剂量进行实验，使该项统计得的P<0.05,则表示差别显著。

⑥碟间：一组实验的双碟在四个以上，应尽量控制双碟间的误差小一些，从而使实验误差减少。当该项统计得的P>0.05时，则表示无显著差别。但在一般情况下，双碟之间的差别总是存在的，故在统计公式中已适当的分除碟间差异。

综上所述，实验最可靠的结论归纳如下： 试品间差别不显著，P>0.05。 回归显著，Ｐ<0.01。 偏离平行不显著，P>0.05。

二次曲线与反向二次曲线均不显著，Ｐ>0.05。 剂间差异显著，Ｐ< 0.01。 碟间差异不显著，Ｐ>0.05。 ２.效价计算 ＰＴ＝Ｒ×ＡＴ

ＰＴ—测得供试品的效价单位数（U/mg或Ｕ／ml）； ＡＴ—供试品的标示量效价或估计效价；

Ｒ— 测得的供试品（Ｔ）的效价相当于ＡＴ的百分率。

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Ｒ＝Ｄ·log-1M M=

VI WＩ：高、低剂量比值的对数 二剂量法：Ｄ＝

dS2dT2标准品高剂量

供试品高剂量1（ΣＴ２＋ΣＴ１－ΣＳ２－ΣＳ１） 21 Ｗ＝（ΣＴ２＋ΣＳ２－ΣＴ１－ΣＳ１）

2 Ｖ＝

本法计算所得效价，如低于估计效价的９０％或高于估计效价的１１０％时，则应调整其估计效价，重新进行测定。

３.可信限计算

由于生物差异性的存在，生物检定的实验误差一般都比较大，故实验结果只是对于真正结果的一个估计值，它对真正结果还有一段距离，可信限（ＦL）就是对真正结果的一个估计范围。因此，可信限是精密度的一个标志，常用来表示实验误差，一般以概率水平Ｐ＝0.95时实验结果的可信限高限和低限的范围来表示，即“实际结果可信限”，在生物检定中，每个品种，根据所规定的检验方法，都可总结出一个正常的可信限率（如英国药典规定抗生素生物检定法的可信限率不得大于５％。中国药典１９９０年版也规定可信限率不得大于５％），若超过这个限率，说明实验结是可疑应重新进行实验。

Ｒ的可信限＝log-1(MSM) Ｒ的可信限低限＝log-1(MSM) Ｒ的可信限高限＝log-1(MSM) ＰＴ的可信限低限＝Ｒ的低限×ＡＴ ＰＴ的可信限高限＝Ｒ的高限×ＡＴ

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ＰＴ的平均可信限（ＦＬ）＝ＰＴPT高限PT低限

2PT高限PT低限100%

2PTＰＴ的平均可信限率（ＦＬ％）＝ＰＴＳＭ为Ｍ的标准误差 ＳＭ＝

ImS2[(1g)AW2BV2] 2W(1g)g是回归系数b的显著性指数。当g<0.1时，可省略g 的计算。 SM=

IW2mS2(AW2BV2)

t2S2m二剂量法：g = A=1 B=1

W2

本法计算所得效价，如低于估计效价的９０％或高于估计效价的１１０％时，则应调整其估计效价，重新进行测定。且本法的可信限率不得大于5%.

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