奈达铂抑制卵巢癌OVCAR-3细胞增殖及下调Hedgehog信号通路相关蛋白水平

CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY

中国组织化学与细胞化学杂志

Vol.26.No.5October.2017

奈达铂抑制卵巢癌OVCAR-3细胞增殖及下调

Hedgehog信号通路相关蛋白水平

刘静波1，郭晨旭2，张文渊2，马玲1*

（1安徽蚌埠医学院第一附属医院肿瘤妇科，蚌埠 233004；2安徽蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，蚌

埠 233004）

〔摘要〕目的 观察PTCH1在卵巢癌组织中的表达，探讨奈达铂抑制卵巢癌OVCAR-3细胞的增殖以及对Hedgehog信号通路相关蛋白表达的影响。方法 应用免疫组织化学染色法检测正常卵巢组织及卵巢癌标本各80例中PTCH1的表达，并观察卵巢癌组织标本中PTCH1表达的规律及其与病理类型、病理分级、淋巴结转移、临床分期、是否行新辅助化疗之间的关系。常规培养卵巢癌细胞OVCAR-3，奈达铂干预后Western blot观察细胞中PTCH1、cyclin D1及Gli1的表达变化情况，CCK-8法检测细胞增殖能力的变化。结果 PTCH1在卵巢癌标本表达率明显高于正常卵巢组织，PTCH1的表达与病理类型、病理分级、淋巴结转移、临床分期无明确联系，但与含奈达铂方案的新辅助化疗的执行相关；奈达铂干预的卵巢癌细胞中PTCH1、cyclin D1及Gli1的表达较未干预组低，其增殖受到明显抑制。结论 奈达铂可以通过干扰卵巢癌中Hedgehog通路关键因子从而影响卵巢癌的发生发展。

〔关键词〕PTCH；Hedgehog信号通路；卵巢癌；奈达铂

〔中图分类号〕R737.3 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2017. 05. 009

Nedaplatin inhibits ovarian cancer OVCAR-3 cell proliferation and downregulates

Hedgehog signaling proteins

Liu Jingbo1, Guo Chenxu2, Zhang Wenyuan2, Ma Ling1*

(1Department of Gynecologic Oncology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, China; 2Department

of Surgical Oncology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu 233004, China)

〔Abstract〕Objective To invesitgate the expression of PTCH1 in ovarian cancer tissues and the inhibitory effect of nedaplatin on ovarian cancer cell proliferation as well as its influence on the Hedgehog signaling pathways. Methods The expression of PTCH1 in normal ovarian and ovarian cancer tissues (80 cases of each) was detected using immunohistochemical staining. The correlation be-tween PTCH1 expression and tumor pathological type and grade, lymph node metastasis, clinical stage, and neoadjuvant chemotherapy was investigated. In cultured ovarian cancer cells, the expression of PTCH1, cyclin D1 and Gli1 in response to nedaplatin treatment were further evaluated by Western blotting, and the cell proliferation was determined by CCK-8. Results The expression level of PTCH1 in ovarian cancer was significantly higher than that in normal ovarian tissues, which was not associated with pathological type, pathological grade, lymph node metastasis and clinical stage. However, neoadjuvant chemotherapy reduced the positive expression rate of PTCH1. The expression of PTCH1, cyclin D1 and Gli1 in nedaplatin treated ovarian cancer cells was lower than that in the untreat-ed group. The proliferation of ovarian cancer cells was significantly inhibited after nedaplatin treatment. Conclusion Nedaplatin can affect the development of ovarian cancer by interfering with the key factors of Hedgehog pathway in ovarian cancer.

〔Keywords〕PTCH1; patched-1; ovarian cancer; nedaplatin

卵巢癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，发病率位于第三位，因卵巢深居盆腔，早期癌变后症状不易察觉，许多患者至医院就诊时，病期已为进展期或晚期，并且由于其复杂的病理类型及组织学特异性，病死率位于女性生殖系统恶性肿瘤的第一位[1]。

Hedgehog(Hh)信号通路是调节胚胎发育中的经典通路之一，Hh信号通路的激活与许多肿瘤的形成

〔收稿日期〕2017-03-30 〔修回日期〕2017-09-11

〔基金项目〕蚌埠医学院科技发展基金项目（Bykfl2A15）〔作者简介〕刘静波，女（1987年），汉族，硕士，住院

医师

*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：ml1970222@163.com

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相关，主要由信号分子Shh、膜受体patched(PTCH)、细胞裂解液（碧云天公司），奈达铂（江苏奥赛康smothened(Smo)、与中间传递分子和核转录因子Gli1组成[2]。Hh还可以通过促进转录因子cyclin E及cyclin D功能抑制Rb基因的功能促进细胞增殖[3, 4]。公司）。

4 PTCH1免疫组织化学染色

将石蜡切片脱蜡、脱苯、水化后，PBS冲洗3过度表达cyclin D则可以促进细胞生长。这个发现证实Hh信号系统的活化与肿瘤形成相关。已有研究表明，在多种恶性肿瘤中Hh信号通路的关键因子都有表达[5-8]。也确有学者证实卵巢肿瘤中存在Hh信号通路，并在部分卵巢肿瘤中存在过度激活的现象[9]。化疗是卵巢恶性肿瘤不可缺少的治疗手段，卵巢上皮性肿瘤的化疗一线药物是紫杉醇+铂类。本研究检测了曾接受含奈达铂新辅助化疗的患者卵巢癌大体标本中PTCH1的表达，并检测奈达铂干预后卵巢癌细胞中Hh信号通路成员分子Gli1以及与Hh通路相关的细胞周期的关键因子cyclin D1的表达，同时检测奈达铂对卵巢癌细胞的增殖影响，以探讨奈达铂通过Hh信号通路对卵巢癌的治疗作用机制。

材料与方法

1 病例资料

收集2012年1月至2016年6月蚌埠医学院第一附属医院妇肿瘤妇科和妇产科术后存档蜡块共80例卵巢癌患者，包含浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌，常规制片。上述病例均为原发性卵巢上皮细胞癌，含奈达铂方案新辅助化疗的病例为25例。另选80例正常卵巢组织的存档蜡块，常规制片。2 细胞株与培养

人卵巢癌细胞株OVCAR-3购自中国科学院武汉细胞库。改良型RPMI1640全培养含20%胎牛血清、1%青链霉素双抗（青霉素100iu/ml，链霉素100mg/ml）。37℃、5%CO2无菌培养箱培养，每2d换液，3~5d以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后传代。3 主要试剂

Elivision plus免疫组织化学试剂盒（深圳新产业生物医学工程股份有限公司），液体DAB酶底物显色试剂盒（上海信然生物科技有限公司），兔抗人PTCH1蛋白一抗（ab53715）和兔抗人Gli1蛋白一抗（ab151796）（英国Abcam公司），兔抗人cyclin D1蛋白一抗（WL01435a）（万类生物科技公司），山羊抗兔IgG二抗（Biosharp公司），RIPA

次（3min/次），放入装有EDTA修复液的修复盒中，用高压锅进行抗原修复；滴加过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min；PBS冲洗3次（3min/次），甩净PBS液后，切片上滴加PTCH1蛋白一抗，室温孵育60min。PBS冲洗后于切片上滴加二抗，室

温孵育20min；PBS冲洗后滴加过氧化物酶聚合物，室温孵育30min，PBS冲洗后，滴加DAB显色剂，3~10min后纯水充分冲洗，苏木素复染3min，纯水充分冲洗后盐酸酒精分化，PBS反蓝；梯度酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封片。

5 PTCH1、cyclin D1和Gli1的Western blot检测

OVCAR-3细胞实验组细胞培养液中加入30ug/ml[10, 11]奈达铂后培养24h，对照组常规培养。RIPA细胞裂解液处理收集的OVCAR-3细胞从而提取细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，利用细胞裂解液调定浓度至60μg/μl，煮沸5min，定量10μl蛋白，按分组加入泳道内，SDS-PAGE电泳后恒流转膜。取出转膜完成的PVDF膜浸于5%脱脂牛奶中封闭，将PVDF膜与一抗稀释溶液（β-actin

稀释比例为1:500，PTCH1为1:1000，cyclin D1为1:1500，Gli1为1:3000）封闭于抗体孵育盒内，4℃孵育过夜。TBST液洗膜后与二抗稀释溶液（稀释比例1:6000）封闭于抗体孵育盒内，4℃孵育1h。TBST液洗膜后底物显色剂曝光，扫描曝光后应用Quantity one软件分析扫描蛋白条带的光密度值，计算蛋白的相对表达量（目的蛋白光密度值/β-actin光密度值）。

6 OVCAR3细胞增殖的CCK-8法检测

收集细胞后分实验组和对照组。实验组的细胞培养液中含30μg/ml奈达铂，对照组细胞培养液无奈达铂。重悬后细胞计数，将细胞浓度调整至1×104/ml，加入96孔板，37℃、5%CO2常规培养，期间常规换液。每个时间点取3孔实验组和1孔对照组，提前3h各加入Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液10μl，除去气泡后继续培养3h，酶标仪读取培养6h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h后的490 nm处吸光度值(OD490)。

第5期刘静波等.奈达铂抑制卵巢癌OVCAR-3细胞增殖及下调Hedgehog信号通路相关蛋白水平 483

7 统计学处理

SPSS 19.0 for win进行数据分析，计量资料以`x± s 表示时，两两比较t检验；计量资料以百分率表示时，PTCH1的表达与临床病理参数之间的关系x检验，期望值<5时采用Fisher精确检验。

结 果

1 卵巢癌标本中高表达PTCH1

正常卵巢组织中PTCH1多呈阴性，偶见弱阳性表达；卵巢癌组织中PTCH1表达呈阳性或强阳性（图1）。PTCH1蛋白在卵巢癌中的表达率明显高于正常卵巢组织（83.75% vs 7.5%，P<0.01）（表1），在早期（Ⅰ、Ⅱ期）和晚期（Ⅲ、Ⅳ期）病例组织中的阳性表达率分别为80.00%和 86.00%，在高/中分化、低分化卵巢癌组织中的阳性表达率分别为86.84%和83.33%；在浆液性卵巢癌、粘液性卵巢癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌组织中的阳性表达率为83.78%、85.19%、80.00%和83.33%；在有、无淋巴结转移的病例组织中的阳性表达率分别为84.09%和83.33%；在经奈达铂新辅助化疗后和未行新辅助化疗的的标本中阳性表达率为68.00%和90.91%（表2）。实验结果显示，PTCH1蛋白的表达与卵巢癌组织的期别、细胞分化程度、淋巴结转移及细胞组织学类型均无明显关系（P>0.05），但与是否新辅助化疗存在明显相关性，表现为新辅助化疗后的标本中PTCH1的表达率较未新辅助化疗的标本低（P<0.05）。

2

表1 PTCH1在正常卵巢组织与卵巢癌组织中阳性表达率Tab. 1 The positive expression rate of PTCH1 in normal

ovarian tissues and ovarian carcinoma tissues组织类型Tissue type卵巢癌组织正常卵巢组织

例数n8080

PTCH1+676

-1372

阳性率（%）83.757.5

x2

91.915

P

<0.01

表 2 PTCH1在卵巢癌组织中的表达及与临床病理特征间的

相关联系

Tab. 2 Correlation of PTCH1 expression in ovarian

carcinoma with clinical pathological features临床病理因素

临床分期

Ⅰ~ⅡⅢ~Ⅳ组织与分级

G1、G2

G3淋巴结有转移无转移病理类型浆液性粘液性子宫内膜样透明细胞癌新辅助化疗

-+

5525

5017

58

90.9168.00*

5.052

0.025

3727106

312385

6421

83.7885.1980.0083.33

0.145

0.986

4436

3730

76

84.0983.33

0.008

0.927

3842

3334

58

86.8483.33

0.509

0.476

3050

2443

67

80.0086.00

0.153

0.696

例数

n

PTCH1+-阳性率

x2

P

*：与未进行新辅助化疗组对比较，0.01图 1 PTCH1在正常卵巢组织（A）与卵巢癌组织（B）中的免疫组织化学表达。比例尺，50μm

Fig. 1 The immunohistochemical expression of PTCH1 protein in normal ovarian tissues (A) and ovarian carcinoma tissues (B). Scale bar, 50μm

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第26卷

2 奈达铂下调OVCAR-3细胞中PTCH1、cyclin D1、Gli1水平

Western blot检测发现，对照组OVCAR-3细胞中PTCH1、cyclin D1、Gli1相对表达量分别为0.762±0.021、1.161±0.002和1.461±0.027；经

奈达铂干预后的OVCAR-3细胞中PTCH、cyclin D1及Gli1的相对表达量分别为0.389±0.023、0.583±0.004和0.614±0012，3种蛋白的相对表达量均低于未干预组（P<0.05）（图2）。

图 2 奈达铂对OVCAR-3细胞中PTCH1、cyclin D1及Gli1水平的影响。A，代表性Western-blot检测结果；B，奈达铂干预对 PTCH、cyclin D1和Gli1水平影响的统计学分析； **：与未处理对照组比较，P<0.01（n=3）

Fig. 2 Effect of nedaplatin on PTCH1, cyclin D1 and Gli1 expression levels in OVCAR-3 cells. A, representative Western-blot results; B, statistical analysis of nedaplatin effect on PTCH1, cyclin D1 and Gli1 expression levels in OVCAR-3 cells detected by Western-blot; **: P<0.01, compared with untreated control group（n=3）

3 奈达铂抑制OVCAR-3细胞的增殖

利用CCK-8法检测奈达铂对OVCAR-3细胞增殖的影响显示，与未处理对照组相比，经奈达铂干预后的OVCAR3细胞的增殖明显受到抑制（图3）。

分子生物学特性，寻求卵巢癌的临床治疗策略。紫杉醇联合卡铂/顺铂方案是目前被广泛应用的卵巢癌一线化疗方案，但因其产生耐药现象，影响了临床疗效。奈达铂是新一代铂类抗癌药物，它具有10倍于顺铂的水溶性，其抗肿瘤的机理是阻碍DNA的复制，其肾毒性和消化道毒性要轻于其他铂类，抗肿瘤活性与顺铂相当，并强于卡铂，而且与顺铂、卡铂无完全交叉耐药性，是患者在对顺铂、卡铂耐药后的绝佳选择[17]。

本实验结果显示，卵巢癌组织中PTCH1的表达呈阳性或强阳性，且与肿瘤期别、肿瘤病理类型、肿瘤病理分级、有无淋巴结转移无明显相关性，而与是否行奈达铂新辅助化疗相关，这说明PTCH1在卵巢癌的发生发展中可能确实存在着异常的激活，并显示奈达铂可以有效的降低卵巢癌中PTCH1的表达。Western blot的结果也进一步证实了卵巢癌细胞中PTCH1的表达升高，同时Gli1和cyclin D1的表达也是增高的。说明Hh信号通路及其相关蛋白着实参与了卵巢癌的发生发展，并且扮演着促进者的角色。在Hh信号通路中，膜受体PTCH、SMO及转录因子Gli1尤其重要，PTCH常态下与SMO相结

图3 奈达铂抑制OVCAR-3细胞的增殖。CCK-8法检测奈达铂对OVCAR-3细胞增殖影响的统计学分析；与未处理对照组比较：**，P<0.01（n=3）

Fig. 3 The effects of nedaplatin on OVCAR-3 cell proliferation. Statistical analysis OVCAR-3 cell proliferation detected by CCK-8; **, P<0.01, compared with untreated control group (n=3)

讨 论

卵巢癌在女性生殖系统恶性肿瘤中预后最差，卵巢癌的基础研究通常从基因信号通路出发探讨其

第5期刘静波等.奈达铂抑制卵巢癌OVCAR-3细胞增殖及下调Hedgehog信号通路相关蛋白水平 485

合能够抑制下游基因的表达，当PTCH增加，活化的Shh（PTCH是Shh的配体）能够与之结合并解除与SMO的结合从而解除抑制效果，向下传导，并激活Gli1，引起细胞的非程序的无限制增殖，形成肿瘤趋势，而促使细胞增殖最直接的途径即是细胞周期蛋白的激活，Cyclin D1又是最重要的细胞周期蛋白之一，同时也有研究证实，Hh信号转导途径可以促进Cyclin D1的表达。

细胞的生长与增殖受到Hh信号通路控制，而奈达铂干预后的卵巢癌细胞中Hh信号通路相关的因子被调低，意味着会对卵巢癌细胞的增殖产生一定的影响。本实验证实了在奈达铂干预后卵巢癌细胞的增殖明显受到抑制，这一效应这也就为奈达铂通过Hh通路影响卵巢癌的发生发展提供了最终效应证据。

本实验进一步证实了卵巢肿瘤中存在Hh信号通路，实验的意义及远期应用的前景为：PTCH1蛋白的检测可能用于临床上对于卵巢肿瘤发生危险的相关性指标并作为肿瘤标记物，可能用于卵巢癌的诊断。同时也为卵巢癌的靶向治疗和基因治疗提供新的方向。课题组接下来将继续深入探讨卵巢癌发生发展中Hh信号通路的作用机制，更全面为卵巢癌的基因靶向治疗提供一条扎实可行的道路。

参 考 文 献

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