透明质酸的制备及作为药用材料方面的应用进展

·综述·

透明质酸的制备及作为药用材料方面的 应用进展

王超，张明春

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种独特的线性大分子黏多糖，由葡萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接而成。HA 广泛存在于动物和人体结缔组织细胞间质中，在眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中含量较高，血清中含量最低。近年来，HA 作为一种可吸收、可降解的生物材料，并因其高度的黏弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，作为药用材料在医药领域的应用中取得了显著进展，现本文就相关内容做一综述。

1 HA 的理化特性及生理功能

HA 广泛存在于动物的各个组织间质中，如皮肤、脐带、眼玻璃体、鸡冠、关节滑液、软骨、卵细胞、血管壁等；另外，HA 也是链球菌、绿脓杆菌等菌株荚膜的主要成分。虽然不同来源获得的 HA 相对分子质量不同，它们之间却不存在种属差异，对人及动物均无抗原性[1]。在不同组织中 HA 的生理作用也有所不同：在皮肤中主要表现为保水作用；在关节滑液中主要表现为润滑作用；在血管壁中主要表现为通透性调节作用；另外，HA 作为聚阴离子电解质，分子上所携带的大量负电荷可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性。天然 HA 具有良好的生物相容性，但在组织中易被降解和扩散，体内存留时间较短，经修饰和交联后得到的 HA 衍生物则可弥补这一缺陷。近年来 HA 衍生物在生物医药领域中得到了不断的开发与应用，如作为软组织填充剂、防黏连剂、组织修复材料以及缓释、靶向和控释药物的载体等等[2-4]。

2 HA 的制备方法

2.1 动物组织提取法

从动物组织中提取 HA 常用的原料主要有眼睛、鸡冠、脐带和猪皮等，主要工艺过程包括脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。颜延宁[5]

用蒸馏水提取，氯仿去蛋白，乙醇沉淀和纯化方法成功地从鸡冠组织中获得 HA；秦乾安等[6]采用鱿鱼眼作为原料提取 HA，并根据实验结果得出鱿鱼眼初提取液的去蛋白酶解最佳条件为：中性蛋白酶浓度 1.0%，酶解温度 50 ℃，酶解时间 6 h，该条件下 HA 得率为 85.7%、相对分子质量损失率为 10.6%、蛋白去除率为 91.1%；Volpi 和 Maccari[7]则联合开发了一种新原料，从软体动物贻贝中也提取获得了 HA。这些方法的特点是工艺流程简单，适用于原料来源分散的小规模生产。但由于原料有限，且原料中 HA 的含量较低，同时 HA 与硫酸软骨素等

黏多糖共存于生物组织中，也导致其收率低、提纯难、成本过高、产品质量差，难以应用于大规模生产。 2.2 微生物发酵法

2.2.1 菌株的选育与诱变 自发现链球菌可产生 HA 以来，这一研究结果便引起了人们的广泛关注。链球菌属的多种细菌都具有荚膜，这种荚膜的主要成分就是 HA。魏甲乾等[8]选用兽疫链球菌 CVCC1917，

将重离子束流应用于菌种的诱变处理，获得了较高的突变率，效果显著，而经过双重辐照诱变得到的 H-7 突变菌株发酵性能稳定，HA 产率基本稳定为 1.8 ~ 2.3 g/L；罗强和孙启玲[9]采用 N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（NTG）诱变原生质体，选育菌种为兽疫链球菌 H-35，经过发酵条件的优化后，发酵液中 HA 的含量从最初的 0.47 g/L 提高至优化后的 1.43 g/L；罗瑞明等[10]对兽疫链球菌进行紫外诱变，结果使 HA 的产量提高至 3.0 g/L，同时其相对分子质量也有较大提高；邓静等[11]分别以微波、超声波以及微波-超声波复合诱变选育 HA 产生菌，结果获得 1 株高产突变株，其 HA 的产量较出发菌株提高了 60%，且经过 5 次传代后，该突变菌株的遗传性状保持稳定。此外，目前最新的基因工程育种方法，不但可以完全突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交，而且这种远缘杂交既可跨越微生物间的种属障碍，还可以实现动物、植物、微生物之间的杂交。

2.2.2 发酵液的预处理 预处理是在分离纯化前对发酵液进行灭酶、灭菌、除菌的工艺。对于一些非 HA 酶缺陷型菌株发酵获得的发酵液，通过预处理可以杀灭 HA 酶，减少 HA 相对分子质量的降低，提高 HA 的提取率。

邓禹等[12]针对 HA 发酵液中菌体和蛋白质的物化特性，选用 25 g/L 三氯乙酸灭活菌体并使蛋白质变性沉淀，以发酵液质量为 1.2% 的混合硅藻土（粗、细硅藻土质量比为 1.5:1）作为过滤助剂，采用过滤温度 60 ℃、pH7.0 的发酵液预处理工艺提取 HA，再配以乙醇沉淀、气浮、造粒的后处理工艺，所得成品 HA 中葡萄糖醛酸的含量达 46.39%，蛋白质含量仅为 0.047%，其相对分子质量为 1.9 × 106，提取收率达 91.3%；史鹏等[13]比较了热处理和酸处理 2 种方法对微生物发酵法生产提取的 HA 相对分子质量降低的影响，结果显示用三氯乙酸将发酵液的 pH 值调为 4.5， 作者单位：300134 天津商业大学生物技术与食品科学学院制药工程系 通讯作者：张明春，Email：zhmchun@tjcu.edu.cn 收稿日期：2009-08-28

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可更有效地防止 HA 的降解；周荣清等[14-15]通过测定过滤滤饼常数、透光率以及处理前后 HA 浓度的变化，分析讨论了用絮凝法预处理 HA 发酵液的合理性，实践证明 HA 发酵液经絮凝预处理后，不仅可以大大改善发酵液的固液分离效果，同时其滤清液中 HA 的纯度亦有一定幅度的提高，在超滤过程中污染程度亦明显减少，且增加了渗透通量。 2.2.3 HA 的分离纯化与提取 HA 的分离纯化是生产 HA 的关键步骤之一，分离纯化方法的优劣不仅关系着产品质量，同时还影响到生产成本。乙醇沉淀是分离各种多糖常用的一种方法，可以使 HA 有效脱水、脱色，从而提高产品品质。预处理时由于发酵液黏度较高，离心或过滤前往往要对发酵液进行稀释，HA 常因稀释而导致浓度较低，直接采用乙醇沉淀会消耗大量乙醇，而浓缩则可以减少乙醇用量。盛瑞堂等[16]采用超滤法对过滤后的发酵液进行浓缩，使 HA 溶液体积减少了 67.1%，相应的乙醇用量降低了 67.1%。可见，在乙醇沉淀前采用膜技术进行浓缩可有利于降低成本和后期纯化。另外，周海东等[17]研究了利用膜技术分离 HA 的可行性，实验结果表明，聚偏氟乙烯（PVDF）材质的膜适合于发酵液的过滤分离，且在一定浓度范围内膜工艺运行稳定；李润等[18]根据 HA 与蛋白质、核酸在结构和性质上的差别以及它们与离子交换剂的作用原理，以含多个氮原子的组氨酸修饰强碱型阴离子树脂，制得可纯化 HA 粗品的新型离子交换剂 —— 组氨酸-强碱型阴离子树脂，用于 HA 粗品的层析分离，取得了良好的分离效果。

从发酵液中分离提纯 HA 是微生物发酵法生产 HA 的关键步骤之一，这就要求进一步加强新提取工艺的开发，在完善传统沉淀、浓缩等分离工艺的同时，使用离子交换、膜过滤、亲和层析等新的分离技术替代传统工艺，从而促进发酵法生产 HA 的工业化应用和推广。

3 HA 作为药用材料方面的应用

3.1 HA 在关节疾病治疗中的应用

HA 是构成关节软骨和滑液的主要成分，当发生骨性关节炎（OA）、类风湿性关节炎（RA）以及其他感染性和非感染性关节疾病时，HA 在关节内的产生和代谢即发生异常，滑液中 HA 的浓度和相对分子质量明显降低，软骨发生降解和破坏，导致关节生理功能障碍。Mendoza 等[19]用 Cu2+ 与过氧化氢反应模拟芬顿（Fenton）反应，称为仿 Fenton 反应（pseudo-Fenton reaction），进一步验证了 OA、RA 均与 HA 的降解有关。黏弹性补充疗法由此应运而生，旨在通过补充外源性 HA，恢复滑液的润滑功能，以促进软骨修复，改善关节功能。迄今为止，大量的临床应用结果表明，HA 对 OA、RA 等关节疾病的治疗效果明确、安全，具有很好的应用前景。 3.2 HA 在骨折愈合中的应用

Kerimoğlu 等[20]研究了含有 HA 以及多种生长因子的人羊水（human amniotic fluid，HAF）对大鼠胫骨骨折愈合的作用，实验表明羊水中的 HA 对骨折愈合具有重要作用。

关节镜微骨折技术（microfracture）用于治疗关节软骨损伤可以促进骨髓干细胞生长，刺激软骨再生；但这种再生的软骨是纤维软骨，不是透明软骨，而且要薄于正常软骨。而 Kang 等[21]在采用关节镜微骨折技术治疗兔关节软骨损伤的基础上应用 HA 凝胶，组织学分析结果显示，再生软骨的厚度明显大于无 HA 凝胶组，且更接近透明软骨，表明 HA 可明显促进骨折愈合。 3.3 HA 作为药物载体的应用

黄建艳等[22]用环氧氯丙烷活化后的相对分子质量小、凝胶温度低的琼脂糖，与 HA 共混接枝制备成琼脂糖-HA 共聚物，再用该共聚物包载胰岛素，红外光谱及元素分析结果显示琼脂糖-HA 共聚物制备成功，释药实验表明包载的胰岛素具有缓释行为；Lee 等[23]研制出一种 HA-紫杉醇结合物，它在水溶液中可形成纳米级胶束聚集体，且在酸性条件下紫杉醇可完整地从胶束中解离，具有靶向性和控释作用，作为特异性肿瘤拮抗剂具有潜在的应用前景；Kumar 等[24]研究发现，

Fe2O3 可以作为将 HA 与纳米粒连接的“桥梁”，并成功地研制出新型 HA-Fe2O3 纳米级脂质体，同时发现这种新型脂质体几乎能够全部将多肽药物输送至靶点。在此基础上，试想如果将抗肿瘤药物（如紫杉醇）包裹于此类脂质体内，必将能够有效提高靶组织或靶细胞内的药物浓度，并可降低用药量。

HA 与多种聚合物在性能上可以相互补充和促进，使得 HA 复合材料载体日益显示出更加优越的特性。但 HA 的亲水性也限制了其作为药物载体的应用广度，因此需要经过化学修饰改善其物理特性，并保持其生物相容性，使 HA 更好地胜任药物载体的角色。

4 结语

综上所述，目前 HA 作为药物材料在医药领域的应用备受关注。在 HA 的研发方面，国内外研究人员已经开始着重对 HA 的修饰及其衍生物的应用进行研究，以解决纯 HA 易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等特性。因此，进一步探索 HA 衍生物的制备途径并扩展其临床应用也已成为当前的发展趋势。

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关于报送“含氟氯化碳类物质药用吸入式气雾剂” 豁免申请材料等有关事宜的通知

按照我国签署加入的《关于消耗臭氧层物质的蒙特利尔议定书》（以下简称《议定书》），除必要用途可以申请豁免外，2010 年 1 月 1 日起完全停止氟氯化碳类物质（CFCs）的生产和消费。凡申请必要用途豁免的，必须每年向《议定书》缔约方大会提出申请，经缔约方大会批准后方可生产和消费。我国使用 CFCs 作为药用辅料的药用吸入式气雾剂（MDI），属于可以申请豁免的范围。为做好 2011 年豁免申请工作，国家食品药品监督管理局于 11 月 23 日就有关事宜下发通知。详情可登陆国家食品药品监督管理局网站查阅（http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0055/43534.html）。