SNP及其在分子植物育种中的应用_王瑞云

学报(自然科学版)2010,30(2)

002644

SNP及其在分子植物育种中的应用

王瑞云,王计平,李润植

(山西农业大学农学院,山西太谷030801)

摘 要:对于多基因控制的数量性状而言,分子标记的数量影响基因的精细定位。在全基因组内进行性状分析的关键是获得大量高通量基于标记的序列。SNP(单核苷酸多态性)是基因组中分布最广的序列变异。本文综述了QTL鉴定的必需元件和基于SNP基因分型的5个中心生化反应原理。关键词:SNP(单核苷酸多态性);分子植物育种;QTL定位

中图分类号:S336 文献标识码:A 文章编号:1671-8151(2010)02-0183-05

SingleNucleotidePolymorphismanditsApplicationinMolecularPlantBreedingWANGRu-iyun,WANGJ-iping,LIRun-zhi

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:Asforthetraitscontrolledbypolygenes,sufficientnumberofpolymorphicmolecularmarkersplayakeyroleinfinemappingofrelatedtraits.Theavailabilityofabundant,high-throughputsequence-basedmarkersisthekeyfordetailedgenome-widetraitanalysis.Single-nucleotidepolymorphisms(SNPs)arethemostcommonsequencevariationandasignificantamountofefforthasbeeninvestedinre-sequencingallelestodiscoverSNPs.Herefourelementsnec-essarytodetectQTLsarereportedandfivecentralbiochemicalreactionprinciplesthatunderlieSNP-genotypingmeth-odsarereviewed.

Keywords:SNP(Single-nucleotidepolymorphism);Molecularplantbreeding;QTLmapping

QTL定位分析是对位于同一位点的等位基因及其产生的表型进行的统计研究。由于多数目标性状是多基因控制的,定义和研究相关性状基因的所有基因座有助于在真正意义上了解个体基因型带来的遗传效应

[1]

和分子标记。和形态学标记和同工酶标记不同,DNA标记在数量上是无限的,而且不受环境和植物发育阶段的影响,因此分子标记在植物育种中得到广泛运用。分子标记来源于各种类型的DNA变异如替换、重组或串联重复DNA在复制中出现错误。分子标记包括基于标记的杂交、基于标记的PCR、基于杂交的PCR的分子标记和基于标记的序列测定和DNA芯片等。113 个体表型的获得

估计的M-QTL遗传参数(如遗传效应、基因组位置和基因作用)的准确度随表型误差发生很大的变化。作图群体的特性和大小及重复的运用在降低表型误差的表型鉴定中起重要的作用。114 连锁分析

构建连锁图的最后一步包括各个DNA标记在每个个体的编码数据和用计算机程序进行连锁分析。如果标记数目较少,则可以进行人工操作来

。

1 鉴定QTL的必需元件

111 定位群体的构建

鉴定QTL的首要元件是构建使目标性状发生分离的定位群体。作图群体的亲本在一个或多个目标性状上存在差异。通常初级作图群体需要的个体数量为50~500株。然而,高分辨率精细定位则需要较大的群体。定位群体通常包括初级作图群体和次级作图群体两种,后者更有利于提高QTL定位的准确性。112 个体基因型的获得

遗传标记的类型主要有形态学标记、生化标记

收稿日期:2009-12-21作者简介:王瑞云(1969-),女(汉),山西平定人,副教授,博士,硕士生导师,主要从事分子植物育种方面的研究。基金项目:山西农业大学博士科研启动项目资助(XB2008005)

184山西农业大学学报(自然科学版)2010

对标记进行连锁分析;如果标记数量庞大,其连锁分析必须用计算机程序。常用的分析软件包括Mapmaker/EXP、JoinMap和MapManagerQTX等[2~5]。

异

[16]

SNP标记是个体间发生的最普遍的遗传变异形式,大约每1000个碱基对中有一个碱基发生变

。单个碱基的indel(插入缺失)就是SNP。早期基因组学应用在孟德尔因子的基因定位方

2 分子标记辅助选择

分子标记在辅助选择育种中有3种方式。首先,辅助选择那些不易观察到表型的基因(如隐性多基因和同一基因型中聚合着多种抗病基因)和表型检测费用高于标记检测费用的基因。

第二,对于目标基因附近的基因发生重组后,产生的后代很少,这些重组子具有目标等位基因和很少的供体染色体片段。即使传统回交多代后,大量目标基因附近的供体亲本的染色体仍会保留下来。如果供体亲本是野生的或外源的,这种背景材料容易引起/连锁累赘0,减少导入的染色体片段是成功获得回交新品种的关键。染色体单片段代换系就是近年来发展起来的次级作图群体,在回交和标记辅助选择育种中得到广泛运用[6~9]。

第三,在标记辅助回交育种中,与目标基因不连锁的标记相当有用。通过选择具有绝大部分轮回亲本遗传背景的后代,如回交2代后,后代含有平均8715%的与目标基因不连锁的轮回亲本等位基因。然而,在后代中这个平均8715%的区域会发生变异,/背景标记0可以用来鉴定那些与轮回亲本类似的后代。这样在给定的群体中,在减少了回交次数的前提下,获得98%或99%轮回亲本遗传背景。

面,而SNP的出现则可以鉴定和定位多基因变异的QTL。一方面,SNP为扫描和QTL连锁的基因组提供了工具。另一方面,QTL的绝大部分效应基本都来源于尚未鉴定的SNP。基于以上原因,SNP变异的分布特征是基因组计划的主要目标。

由于SNP数量众多,加之先进的高通量SNP检测系统的研制,SNP标记将对未来的定位研究和MAS将产生重大的影响。以下综述了基于SNP基因分型的5个中心生化反应原理。311 基于限制性位点切割的方法

等位基因的单核苷酸差异产生的限制性位点可以用作CAPS标记[17]。PCR-RF-SSCP(PRS)标记将CAPS标记和SSCP标记整合在一起,可望成为分析DNA多态性的有效工具。

在非变性条件下,单或多核苷酸转变成单链DNA分子的电泳活动,使SSCP分析在甘蓝等物种的DNA变异和多态性检测中得到广泛应用[19~21]。

为了不通过单核苷酸来区别无限制性位点的等位基因,MichaelsandAmasino

[17][18]

设计了如下方

法:用包含有1~2个错配的引物扩增含有单核苷酸变异的区段,则PCR产物中引入了以上变化,连同等位基因间碱基的变化,这样就在等位基因中营造了一个限制性位点。但是,绝大多数的单碱基变化不会产生限制性位点的差异。312 基于PCR的方法31211 等位基因特异引物

用3'末端位于变异位点的延长引物通过PCR特异扩增目标基因的方法。当这个碱基和特异等位基因互补时,DNA片段就被扩增了;当这个碱基和特异等位基因不互补时,PCR将不能进行。31212 多态性序列(SequencePolymorphism-De-rivedSPD)标记

SPD标记对遗传背景相同的个体有高效的指纹图谱。SPD标记可以从无任何信息、传统的分子标记片段中得到。该方法所用的引物中含有单的、3-'末端锁定核酸(LNA)碱基,该碱基是一种二环核酸(此处核糖核苷通过一个次甲基连接在2-'氧和4-'碳原子之间)。被锁定和通过次甲基桥锁定分子,LNA限定在理想的双螺旋结构域。因此,

3 SNP基因分型

在分子标记辅助育种方面,常用的标记如下:基于片段长度不同的标记如SSR,基于限制性内切酶的标记如RFLP[11]、AFLP[12]、CAPS以及基于短多态序列的标记如SCAR和DALP。王加加等以马铃薯晚疫病鉴别寄主MaR10、马铃薯栽培种Katahdin及其杂交一代为试材,结合限制性内切酶筛选出与马铃薯抗晚疫病主效基因R10连锁的两个RGA-CAPS标记。王艳芳等[14]通过航天诱变获得了SCAR标记的番茄无限生长习性突变体。汤洪敏等[15]应用DALP技术分析了云南野生大白口蘑的遗传多样性,从子实体中检测到202个位点,其中多态位点151个。综合运用以上标记,便可通过有限的步骤检测到较多能对重要的等位基因差异进行功能标记的SNP。

[13]

[10]

30(2)王瑞云等:SNP及其在分子植物育种中的应用185

LNA使互补的核酸链配对更迅速,从而增加了双链的稳定性。LNA核苷引起热稳定性的增强,同时也增加了各种结构双链的识别能力。31213 基因组内诱导局部损伤的标定(TILL-ING)

TILLING是近年来发展起来的可获得高通量变异的检测方法,不需要进行遗传转化,适用于能进行诱变处理的植物。该方法需要前DNA序列信息,用一个错配的核酸内切酶来定位和检测诱导产生变异。该方法可以提供一系列沉默、错义、无义、剪接位点变异的等位基因,以便检测各种变异的遗传效应。TILLING已经在小麦、玉米等作物的功能基因组学研究[22,23]中得到应用。Comai等运用TILLING技术对拟南芥自然群体的变异进行检测,发展出Ecotilling技术。王仲平[25]改进了Ecotilling的酶切检测技术,首次将Ecotilling技术应用于水稻,发现了一个新的Hd6等位基因。为了找到特异基因的核苷酸变化,对用荧光分子进行末端标记的特异基因引物进行PCR。然后,样本经过变性和退火后在多态性DNA链间形成杂交双链。用单链特异核酸酶消化后,杂交双链中错配的碱基对就分开了。通过样品混合、多孔液相处理及凝胶自定位,既可增加处理量又可降低费用。一旦得到了DNA样品,通过混合和列阵,每天可以筛选上千份DNA31214 微序列引物

[26]

[24]

上直接杂交2个探针来寻找SNP,如果对目标DNA而言,SNP多态性位点处的2个探针是一致的,那么它们就会发生连接。在寡聚核苷酸连接酶

列阵中需要设计2个探针:一个是特异等位基因探针,它会杂交到目标DNA上以便其3'碱基直接位于SNP核苷酸上;另一个探针会杂交到提供5'末端的SNP多态性位点的模板上游。如果特异等位基因连接探针与目标DNA相匹配,它将与目标DNA完全杂交从而发生连接。如果存在有错配的3'碱基,通常不会发生连接。可以通过凝胶电泳、MALDI-TOF质量光谱测定法或在大规模应用中通过毛细电泳检测连接或非连接产物。314 基于杂交的方法

31411 特异等位基因寡聚核苷酸探针

这是Ji等[29]于2004年提到的较简单的方法。通过与双色荧光标定的一对特异等位基因探针杂交,将给定SNP的基因型区别开来

[30]

。探针可以

与目标DNA进行碱基配对,目标DNA包含的SNP只有在完全配对的情况下才有稳定性,具有一个错配的杂交则不稳定[31]。

31412 单探针多态性(Single-featurepolymor-phismSFP)

SFP是在寡聚核苷酸列阵中用单个的探针检测多态性,用标准表达列阵替代了专门的基因分型技术。目前,SFP分型技术在酵母、拟南芥、大麦、水稻和小麦等生物中得到广泛运用,而且信噪比随基因组的增大而降低[32~36]。复制列阵可以使精确度提高,从而检测出多态性,但是费用会提高。通过观察列阵中与寡聚核苷酸探针相对应的杂交信号是否出现,每个SFP就被记录下来[38]。315 基于信号的侵入探针(Invaderprobe)方法检测SNP的反应体系有许多,其中多数是基于PCR反应体系的,需要通过凝胶电泳才能检测到。然而,侵入探针技术无需进行PCR扩增反应和凝胶电泳。该技术首先需要用结构特异性核酸酶FEN(flapendonuclease)进行等位基因识别,然后通过FRET(荧光共振能量转移)报告系统检测出SNP。因此侵入探针技术是基于信号而不是基于扩增产物的SNP检测方法。

FEN是从微生物中分离到的核酸内切酶,可以催化切割特异结构[40]。通过杂交特异等位基因重叠寡核苷酸与含有SNP位点的DNA会形成三维复合结构,FEN便可以将三维复合结构切开。在基础侵入列阵中,FEN与2个和目标DNA在一

[39]

[37]

。

在微序列引物延伸反应中,用DNA多聚酶来迅速延伸毗邻核苷酸的引物,这个核苷酸的位置可以用在变异位点与核苷酸互补的单标定核苷三磷酸来分析。因为在相同的条件下,可以分析所有SNP,所以用微序列来分析各种高通量的基因型列阵是很有潜力的。微序列也是定量分析PCR的有用工具[27]。该技术是基于和多态性目标位点相毗邻的单个引物的退火的基础上的。用荧光标记的双脱氧核糖核酸(ddNTP)和其它脱氧核糖核酸(dNTP),3'引物通过DNA多聚酶延伸。DNA多聚酶将使微序列引物一直延伸直到ddNTP被整合进去。产物大小随引物和核苷酸序列大小的变化而变化。每个引物加的尾部大小不同,这样就在同一个反应中形成了不同结构。用自动荧光DNA顺序分析仪就可以观察到微序列产物[28]。313 基于特异等位基因连接探针的方法

DNA连接酶通过催化作用将DNA片段的3'末端连接到5'末端,可以通过在SNP多态性位点

186山西农业大学学报(自然科学版)2010

起的寡核苷酸探针结合后,形成由3个部分组成的可以被FEN识别的结构。第一个探针叫侵入寡核苷酸,和目标DNA的3'末端互补。侵入寡核苷酸的最后一个碱基是与目标DNA的SNP寡核苷酸重叠的不匹配碱基。第二个探针叫等位基因特异探针,和目标DNA的5'末端互补,并且延伸超出SNP寡核苷酸的3'端。等位基因特异探针含有一个与SNP寡核苷酸互补的碱基。如果目标DNA含有靶标等位基因,侵入探针和等位基因特异探针将绑定到目标DNA上,形成由三部分组成的结构。FEN识别该结构后,将切开并释放等位基因特异探针的3'末端。如果目标DNA的SNP寡核苷酸和等位基因特异探针不互补,不能形成正确的由三部分组成的结构,FEN就不会发生作用。

侵入列阵常常和FRET系统一起用以检测FEN的切割事件。在FRET报告系统中,每个等位基因都有其对应的荧光共振能量转移对。每个荧光共振能量转移对由一个荧光标签和标签特异荧光猝灭剂组成。每个侵入探针都具有等位基因特异性,结果整合后即可得到样品的基因型。等位基因特异探针的3'末端附加了一个猝灭剂分子,5'末端附加了一个荧光基团。如果FEN发生作用,荧光基团将与猝灭剂分子分离,从而产生可视信号

[41]

2006年,Tadokoro等[42]在侵入探针技术的基础上,运用PCR-侵入信号扩增反应列阵(PCR-in-vasivesignalamplificationreactionassay)对10个已知的乙型肝炎病毒进行了分类,为该项技术在植物育种领域的推广和运用提供了参考。

4 结语

植物的许多农艺性状是由多基因控制的数量性状,为了鉴定和克隆与这些农艺性状相关的基因,首先需要对靶标性状的QTL进行鉴定。QTL鉴定的必需元件首先是构建定位群体,然后通过运用SSR等标记进行电泳和田间观察等考种方法分别获得该遗传材料的基因型和表型数据,最后运用Mapmaker/EXP等作图软件将基因型和表型数据整合在一起,构建连锁图。

鉴定QTL的最终目标是对靶标性状的QTL进行克隆,而图位克隆取决于有高频率的多态标记,这些标记可以将重组事件进行有序的排列。SNP是影响单核苷酸的自然变异,这些标记是个体间存在遗传变异的最普遍的形式,文章综述了基于SNP基因分型的5个中心生化反应原理,这些方法的推广和综合运用将促进分子标记辅助育种和定位克隆,加速植物改良的进程,进而为全人类的食物安全提供保障。

。

参 考 文 献

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(编辑:马荣博)