３０ ２００６，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．０５ ※基 检测赭曲霉毒素Ａ（ＯＴＡ）的酶联免疫吸附法 （ＥＬＩＳＡ）体系的建立 熊勇华１，陈雪岚２，许杨１ （１．南昌大学食品科学教育部重点实验室，汀西南昌 ３３００４７； ２．江西师范大学生命科学学院，江西南昌 ３３００４６） 摘要：本文分别以自制抗一ＯＴＡ兔血清抗体（ＩｇＧ）及鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）就影响检测ＯＴＡ的ＥＬＩＳＡ（酶联免疫吸附法） 体系因素进行了探讨，建立了检测ＯＴＡ的ＥＬＩＳＡ方法。鸡卵黄抗体的最佳ＥＬＩＳＡ操作参数为：包被抗原浓度为 ７．５ｕｇ／ｍｌ，封阻剂浓度为２．５％，抗体稀释倍数为１０００，酶标二抗稀释倍数为１４０００；兔血清抗体的最佳ＥＬＩＳＡ操 作参数为：包被抗原浓度为２．５ｕｇ／ｍｌ，封阻剂浓度为２．５％，抗体稀释倍数为８０００，酶标■抗稀释倍数为１００００。 Ｉ鐾Ｇ和ｉｇＹ的检测灵敏度分别为１０ｎｇ／ｒｒｄ和１ｎｇ，ｒＩｌｌ。 关键词：赭曲霉素Ａ：酶联免疫吸附法 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ（ＯＴＡ） ＸＩＯＮＧ Ｙｏｎｇ—Ｈｕａ ，Ｃｈｅｎ Ｘｕｅ—Ｌａｎ ，ＸＵ Ｙａｎｇ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４７，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｉａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｅ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｈｔｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｉｔｖｅ ＥＬＩＳＡ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ＯＴＡ ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ－ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｒａｂｂｉｔ ｓｅｕｒｍ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＩｇＧ）ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｕｂｌｉｎ ｙｏｌｋ（ＩｇＹ）．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ＥＬＩＳＡ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｉｈｔ ＩｇＹ ｗｅｒｅ ｈｔａｔ ｈｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｗａｓ ７．５ｖｇ／ｍ１．２．５％ａｎｄ ｈｔｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ ｏｆ ＩｇＹ ｎａｄ ｎａｔｉ－ｃｈｉｃｋｅｎ ｒａｂｂｉｔ ｎａｔｉｂｏｄｙ－ 收稿日期：２００５．０２．２８ 基金项目：江西省科技厅农业重点课题（２００３１５Ａ） 作者简介：熊勇华（１９７０一），男，副研究员，博士，研究方向为食品生物技术。 中性蛋白酶有限水解小麦蛋白时，水解速率随水解 史德青，何志敏，齐崴．蛋白质酶促水解过程集总动力学研究［Ｊ】．化 度呈指数下降变化，同时，酶活力也随之降低。这可 学反应工程与工艺。２００２，１８（４）：３１５—３２２． 能足由于酶的变性以及底物和水解产物中存在抑制酶活 Ｎ Ｂｏｍｂａｒａ，Ｍ Ｃ Ａｎｏｎ，Ａ Ｍ Ｒ．Ｐｉ１ｏｓｏｆ．Ｆｕｎｃｆｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏ— ｔｅａｓｅ ｍｏｄｉｉｆｅｄ ｗｈｅａｔ ｆｌｏｕｒｓ［Ｊ］．Ｌｃｂｅｎｓｍ—Ｗｉｓｓ Ｕ Ｔｅｃｈｎｏｌ。１９９７，３０： 成分的原因。 ４４１—４４７． 根据酶反应动力学的基本理论，由实验数据得到描 刘磷，叶峰。欧志敏．蛋白质酶法有限水解过程反应机理和动力学 述中性蛋白酶ｐＨ６．５和温度４０℃条件下有限水解小麦蛋 特性【ＪＪ．化工学报，２００２，５３（２）：１９９—２０２． 白的动力学方程如下： 黄伟坤 食品检验与分析【Ｍ］ 北京： ｝Ｊ国轻工业出版社。１９８４．５１— ５２． ｘ＝２．７９３ Ｉｎ【１＋８１．２８４（ 一０．００１７５）ｔ］ Ａｄｌｅｒ—Ｎｉｓｓｅｎ Ｊ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆ０ｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｍ］．Ｌｏｎｄｏｎ： 上述方程可以用来指导和优化酶解反应实验。 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｆｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｆｉｓｈｅｒｓ．１９８６．１２一ｌ４． 郭勇 酶工程【Ｍ］．北京：中国轻工业出版社。１９９４．３１４＿３１６． 参考文献： Ａｌｎａ Ｆｅｒｓｈ．酶的结构和作用机制【Ｍ］ 杜锦珠，茹炳银。 新成译校． 北京：北京大学出版社，１９９１．６７３—６７４． ［１１ Ｋｅｎ Ｍ Ｍａｇｎｕｓｏｎ．Ｕｓｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｂｉｔｙ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｇｌｕｔｅｎ［Ｊ］．Ｃｅｒｅａｌ Ｋｌａｕｓ Ｒ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ａｎｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｌｉｎｅ ｆｉｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｆｏｏｄｓ Ｗｏｒｌｄ，１９８５，３Ｏ（２）：１７９—１８１． ｔｏ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｄａｔａ［Ｊ］．Ａｉｃｈｅ Ｊ。１９６７。１３：１１３２—１１３６． 闭 吲 维普资讯 http://www.cqvip.com
※基 ２００６，Ｖｏ１．２Ｌ Ｎｏ．０５ ３１ ＨＲＰｗｅｒｅ １０００ ａｎｄ １４０００。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐａｒａｍｅｔｅｒｓｗｉｔｈ ｒａｂｂｉｔＩｇＧｗｅｒｅｔｈａｔｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆａｎｔｉｇｅｎａｎｄ ｂｌｏｃｋａｄｅｄ ａｇｅｎｔ ＷａＳ ２．５．ｇ／ｎ￣．２．５％ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｕｌｉｔｐｌｅｓ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｎｄ ａｎｔａｉ—ｒａｂｂｉｔ ｇｏａｔ ｎｔａｉｂｏｄｙ—ＨＲＰ ｗｅｒｅ ８０００ ｎｄ ａ１００００，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｈｅ ｔＥＬＩＳＡ ｗｉｈ ｔＩｇＹ ｎｄ ａｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｗｅｒｅ １０ｕ￣ｗａ ｎｄ ｌａｎｇ／ｍｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｏｃｈｒａｔｏｘｉｎ Ａ（ＯＴＡ）；ＥＬＩＳＡ 中图分类号：￥８５２．４４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２．６６３０（２００６）０５．００３０—０６ ＯＴＡ是曲霉属和青霉属的某些产毒菌株的次级代 谢产物，属烈性的肾脏毒和肝脏毒，动物实验表明摄 混匀，同时设置阳性对照和空白对照（以ＰＢＳＴ代替抗 体）；鸡卵黄抗体除以ＰＢＳＴ稀释１０００倍外，其它同上； （４）每孔加ｌＯＯｐｌ ｌ：１００００稀释的羊抗兔ＩｇＧ：ＨＲＰ（￣鸡卵黄 入了被这种毒素污染的饲料后，会发生急性或慢性中 毒症，且文献报道０ＴＡ还具有致痛、致畸、致突变 性【１，２１。由于ＯＴＡ具有耐热性，用普通的加热方法处理 不能将其破坏，而自然界中能产生ＯＴＡ的真菌分布广 泛，因此防止污染ＯＴＡ的食品和饲料直接或问接地进 入人类食物链，加强对ＯＴＡ的检测显得尤为必要。本 实验分别以自制抗一ＯＴＡ兔血清（ＩｇＧ）及鸡卵黄抗体（ＩｇＹ） 就影响检测ＯＴＡ的ＥＬＩＳＡ体系【土１素进行了探讨，建立 了检测ＯＴＡ的ＥＬＩＳＡ方法。 １ 材料与方法 １．１ 试剂 赭曲霉毒素Ａ、邻苯二胺、羊抗兔ＩｇＧ；ＨＲＰ酶 标二抗（１：１００００）、兔抗鸡ＩｇＧ．ＨＲＰ酶标二抗（１：１２０００） Ｓｉｇｍａ公司；赭曲霉毒素Ａ与牛血清白蛋白偶联物（ＯＴＡ． ＢＳＡ，其偶联比为９．６３：１）、赭曲霉毒素Ａ与卵白蛋白 偶联物（ＯＴＡ—ＯＶ，其偶联比为５．０：１） 自制；９６孔酶标 板 上海生化公司进口产品；柳硫汞 上海中心站化工 厂。其它试剂均为分析纯。 ｌ＿２ 仪器 酶联免疫枪测仪、八孔可调移液器、微量移液 器 芬兰Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ公司。 ｌ＿３ 间接非竞争ＥＬＩＳＡ法评价微孔板质量 随机取５块微孔板，采用间接非竞争ＥＬＩＳＡ法评价微 孔板质量。在相同实验条件下测定微孔板ＥＬＩＳＡ结果的吸 光值，每块板随机各取１ ０个孔的吸光值用于质量评价。 １．４ 枪测ＯＴＡ的间接竞争ＥＬＩＳＡ方法的建立 为了研究各因素对问接竞争ＥＬＩＳＡ的影响，首先应 确定其基本操作参数。根据文献及预备实验，基本操作 参数如下：（１）１００￣ｌ的包被抗原ＯＴＡ—ＯＶ（ＯＴＡ．ＯＶ溶于 Ｏ，０５ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ９．５的碳酸盐缓冲液中，浓度为１０ ｌａ ｇ／ｍ１）： （２）２００￣ｌ ５％的脱脂牛奶（溶于ＰＢＳ）作为封阻液；（３）加入以 ＰＢＳＴ稀释的兔抗血清９０ｕｌ（１：８０００稀释），同时加入不同 浓度的ＯＴＡ溶液１０ｌａｌ，使ＯＴＡ反应终浓度分别为： １２５００、１２５０、１２５、１２．５、１．２５、０．１２５、０．０１２５ｎｇ／ｍｌ， 抗体时，ｌ：１２０００稀释的兔抗鸡ＩｇＧ：ＨＲＰ）；（５）每孔加反 应底物（６ｍｇ邻苯二胺溶于１ ５ｍｌ ｐＨ５．０ ０．２ｍｏｌ／Ｌ醋酸一０． １ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ缓冲溶液中，同时加入２２．５ ｕ ｌ Ｈ ０ｚ，现配 现用）１００ｐｌ，３７℃保温保湿避光反应３０ｍｉｎ，每孔５０ｕ ｌ ２ｍｏｌ／Ｌ ＨｚＳ０４终止反应５ｍｉｎ后，以空白对照孔调零， ４９２ｎｍ测吸光值。（６）制作竞争抑制曲线，以间接竞争 ＥＬＩＳＡ反应中抑制率达到５０％时所对应的毒素浓度为灵 敏度（１ ５０）。 １．４．１ 单因素分析 １．４．１．１ 包被抗原浓度的影响 其它操作参数不变，以不同包被抗原浓度２０、１５、 ｌ０、５、２．０ ｇ／ｍｌ包被微孔板，测定不同包被抗原浓度 对竞争抑制曲线的影响。 １．４．１．２ 封阻剂浓度的影响 鸡卯黄抗体的间接竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的操作参数 为：包被抗原浓度为ｌ０ ｇ／ｍｌ，其它操作参数不变： 兔血清抗体的间接竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的操作参数为： 包被抗原浓度为５ ｇ／ｍｌ，其它操作参数亦不变，以不 同封阻剂浓度２．５％、５％、７．５％、ｌ０％的脱脂乳封阻 微孔板，测定不同封阻剂浓度对竞争抑制曲线的影响。 １．４．１．３ 抗体稀释倍数的影响 鸡卵黄抗体的问接竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的操作参 数为：包被抗原浓度为１０ｕｇ／ｍｌ、封阻剂浓度为５％； 兔血清抗体的问接竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的操作参数为； 包被抗原浓度为５ ｕｇ／ｍｌ，封阻剂浓度为５％，其它操作 参数不变，以不同稀释倍数的抗体（卵黄抗体按１：５００、 ｌ：１０００、１：２０００、１：４０００稀释；兔血清抗体按１：４０００、 １：６０００、ｌ：８０００、１：１００００、ｌ：１２０００稀释）包被微孔板， 测定不同抗体稀释倍数竞争抑制曲线的影响。 １．４．１．４ 酶标二抗稀释倍数的影响 鸡卵黄抗体的包被抗原浓度为１０ ｌａ ｇ／ｍｌ，封阻剂浓 度为５％的脱脂乳，抗体稀释倍数为１０００，以不同酶标 二抗稀释倍数１：１４０００、１：１２０００、ｌ：１００００、１：８０００、ｌ： 维普资讯 http://www.cqvip.com
３２ ２００６，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．０５ ※基 ６０００，测定不同酶标二抗稀释倍数对竞争抑制曲线的影 试剂～定时，以板问板内误差来衡量微孔板的质量。板 响。兔血清抗体的包被抗原浓度为５ ｌａｇ／ｍｌ，封阻剂浓 内误差太大会影响实验的准确性，板间误差太大会影响 度为５％的脱脂乳，抗体稀释倍数为８０００，以不同酶标 实验的重复性，微孔板的这两种误差越小越好。本实 二抗稀释倍数１：１２５００、１：１００００、１：７５００、１：５０００，测 验按１．３随机抽取５块板，在相同实验条件下，采用问 定不同酶标二抗稀释倍数对竞争抑制曲线的影响。 接非竞争ＥＬＩＳＡ法，每块板随机各取１０孔的吸光值分 １．４．２ 间接竞争ＥＬＩＳＡ试验的正交设计 析板 以及板内误差，计算结果如表３。表３结果显示， 在以上单因素试验基础上，进行正交分析，表头 不管板问还是板内误差都小于１０％，说明此板质量较 设计如表１、２。 好，可用于ＥＬＩＳＡ方法的建立。 ２．２ ＯＴＡ检测的间接竞争ＥＬＩＳＡ方法的建立 表１ 卵黄抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ正交表头设计 本实验采用间接竞争ＥＬＩＳＡ法，分别以兔血清和鸡 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ 卵黄抗体为实验材料，对包被抗原浓度、封阻剂浓度、 抗体稀释倍数和酶标二抗的稀释倍数进行了优化研究。 ２．２．１ 不同包被抗原浓度对问接竞争ＥＬＩＳＡ的影响 在其它操作参数不变的情况下，以不同的包被浓度 ２．５、５、１０、１５、２０ｕｇ／ｍｌ包被微孔板，以研究包被 浓度对ＥＬＩＳＡ竞争曲线的影响，结果显示包被浓度对灵 表２ 免血清抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ正交表头设计 敏度影响较大。图１显：示，当包被抗原浓度为１０ ｕ ｇ／ｍｌ Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ 时，ＯＴＡ检测灵敏度为１０ｎｇ／ｍｌ，其它各包被浓度ＯＴＡ ｗｉｔｈ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ 检测灵敏度都比该浓度差，这说明１０１ａ ｇ／ｍｌ对鸡卵黄抗体 是较合适的包被浓度：图２显示，当包被浓度为５ ｌａ ｇ／ｍｌ ｓ ｊ｝｛Ｌ 幂 ２ 结果与讨论 最 宙 ２．１ 间接非竞争ＥＬＩＳＡ评价微孔板的质量 冉 微孔板是ＥＬＩＳＡ反应的“容器和载体”，其质量 的好坏对实验结果影响很大。微孔板质量的影响因素首 先是制造材料，大量的实验证明聚苯乙烯是较好的材 赭曲霉毒素浓度ｌｇ值（ｎｇ／ｍ１） 料，因为用它制造的微孔板对各种抗原及抗体都有较满 意的吸附；其次是微孔板的制作工艺，在材料一定的情 图１ 包被抗原浓度对鸡卵黄抗体的竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的影响 Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ 况下制造工艺是主要的影响因素ｆ３１ 。在操作条件和所用 ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ 表３ 酶标反应板均一性分析 Ｔａｂｌｅ ３ Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｎｉｆｏｒｍ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｂｏａｒｄ 维普资讯 http://www.cqvip.com
※基 ２００６，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．０５ ３３ 不同的封阻剂浓度对鸡卵黄抗体和兔血清抗体的竞争 Ｓ 篓 ＥＬｌＳＡ的抑制曲线基本一致，灵敏度也基本相同。因 此都选用５％的浓度作为封阻剂的浓度进行下面的实验。 ＾％）斛加 ∞ 蔷 昌 冉 赭曲霉毒素浓度ｌｇ￣（ｎｓ／ｍｂ 图２ 包被抗原浓度对免血清抗体的竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的影响 Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ 时，ＯＴＡ检测灵敏度为ｌｎｇ／ｍｌ，其它各包被浓度的ＯＴＡ 检测灵敏度都比该浓度差，这说明５ｕｇ／ｍｌ对兔血清抗 体是较合适的包被浓度。 ２．２．２ 不 封阻剂浓度对间接竞争ＥＬＩＳＡ曲线的影响 本实验采用脱脂奶粉作为封阻剂，就其在不同浓度 ２．５％、５％、７．５％、１０％时对竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的 影响进行了研究，结果如图３、４。从图中可以看到， Ｓ 盖 营 冉 瞳 赭曲霉毒素浓度ｌｇ￣（ｎｇ／ｍｂ 图３ 封阻剂浓度对鸡卵黄抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ曲线的影响 Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ －４ ．３ ．２ 一ｌ ０ ｌ ２ ３ ４ 赭曲霉毒素浓度 值（ｎｇ／ｍ１） 图４ 封阻剂浓度对兔血清抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ曲线的影响 Ｆｉｇ．４ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２．２Ｉ３ 抗体稀释倍数的影响 本实验对鸡卵黄抗体以１：５００、１：１０００、１：２０００、 １：４０００四个稀释倍数进行稀释，包被浓度为１０ｔｌｇ／ｍｌ、 封阻剂浓度为５％，其它条件同前；对兔血清抗体以 １：４０００、１：６０００、１：８０００、１：１００００四个稀释倍数进行稀 释，包被抗原浓度为５ ｇ／ｍ１，封阻剂浓度为５％，其 它条件同前，分别进行竞争ＥＬＩＳＡ实验以考察鸡卵黄抗 体和兔血清抗体的不同稀释倍数对竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线 及灵敏度的影响，结果如图５、６。图中结果表明，鸡 卵黄抗体的稀释倍数为１：１０００时，灵敏度最好；兔血 清抗体的稀释倍数为ｌ：８０００时，灵敏度最好。 Ｓ 坠 怕 一％）斟纂军《ｓｒ囝 慑 宙 ∞ 舳 ∞ 冉 赭曲霉毒素浓度Ｉｇ值（ｎｇ／ｍ１） 图５ 鸡卵黄抗体稀释倍数对竞争Ｅ ＬｌＳＡ抑制曲线的影响 Ｆｉｇ．５ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ２．２．４ 酶标二抗稀释倍数的影响 常用的酶标二抗有辣根过氧化物酶标二抗和碱性磷 酸化酶标二抗，由于辣根过氧化物酶标二抗的线性范围 较碱性磷酸化酶标二抗的宽，所以本实验对鸡卵黄抗体 加 ∞ 维普资讯 http://www.cqvip.com
３４ ２ ＶｏＬ ２７，Ｎｏ．０５ ※基 一 一褂器最《∞苗冉稷 采用兔抗鸡ＩｇＧ的辣根过氧化物酶标二抗，其标称的稀 释倍数为１：１２０００；对兔血清抗体采用羊抗兔ＩｇＧ的辣根 ∞∞ ∞∞∞ 加ｍ Ｏ ∞ ∞ 们 ∞ Ｏ 过氧化物酶标二抗，其标称的稀释倍数为１：１００００。 对鸡卵黄抗体采用的包被浓度为１０ １．ｔ ｇ／ｍ１，封阻剂 浓度为５％，抗体稀释倍数为１：１０００时，就１：６０００、 １：８０００、１：１００００、１：１２０００这四个酶标二抗稀释倍数对间 接竞争ＥＬＩＳＡ曲线的影响进行了研究，结果如图７；对 兔血清抗体采用的包被浓度为５ １．ｔ ｇ／ｍｌ，封阻剂浓度为 ５％，抗体稀释倍数为１：８０００时，就１：５０００、１：７５００、 １：１００００、１：１２５００这四个酶标二抗稀释倍数对间接竞争 ＥＬＩＳＡ曲线的影响进行了研究，结果如图８。图７显示， 兔抗鸡ＩｇＧ酶标二抗稀释倍数为１：１００００时最好；图８显 示，羊抗兔ＩｇＧ酶标二抗稀释倍数为１：１００００时最好。 篓 差 昌 冉 ∞ 鞭 －３ －２ —１ ０ １ ２ ３ ４ ５ 赭曲霉毒素浓度１ｇ值（ｎｇ／ｍ１） 图７ 兔抗鸡ＩｇＧ酶标二抗稀释倍数对间接竞争ＥＬＩＳＡ曲线的影响 Ｆｉｇ．７ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｃｈｉｃｋｅｎ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ＿４ —３ －２ —１ ０ １ ２ ３ ４ 赭曲霉毒素浓度ｌｇ值（ｎｇ／ｍ１） 图８ 羊抗兔酶标＝抗稀释倍数对间接竞争ＥＬＩＳＡ曲线的影响 Ｆｉｇ．８ Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ—ｒａｂｂｉｔ ｇｏａｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＥＬＩＳＡ ２．３ 优化间接竞争ＥＬＩＳＡ操作参数的正交试验 在以上单因素试验的基础上，按表１、２进行正交 试验，以分析其最佳组合，试验结果见图９、１ ０。 从图９可以看出Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ￣灵敏度最好，灵敏度为 ｌＯｎｇ／ｍｌ。Ａ：Ｂ Ｃ：Ｄ 具体为：包被抗原浓度为７．５ ｇ／ｍｌ， Ｓ 篓 差 宙 冉 目 赭曲霉毒素浓度１ｇ值（ｎｇ／ｍ１） 图９ 鸡卵黄抗体间接竞争ＥＬＩＳＡ正交试验 Ｆｉｇ．９ Ｔｈｅ ｏｒｌｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｙｏｌｋ ａｎｔｉｂｏｄｙ —－ ＡｉＢＩＣＩＤ１ 鲫 ∞ ∞ ∞ Ｏ ３ —２ －１ ０ １ ２ ３ ４ ５ 赭曲霉毒素浓度ｌｇ值（ｎ￣ｍ１） 图１ ０ 兔血清抗体的间接竞争ＥＬＩＳＡ正交试验 Ｆｉｇ．１ ０ Ｔｈｅ ｏｒｌｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ 封阻剂浓度为２．５％，抗体稀释倍数为１０００，酶标二抗 稀释倍数为１４０００。从图１０可以看出Ａ Ｂ Ｃ，Ｄ，的灵敏度 最好，灵敏度为ｌｎｇ／ｍｌ。Ａ，Ｂ ３Ｃ Ｄ 具体为：包被抗原浓 度为２．５ ｇ／ｍｌ、封阻剂浓度为２．５％、抗体稀释倍数为 ８０００、酶标二抗稀释倍数为１ ００００。 ２．４ 讨论 本实验探讨了包被抗原浓度、封阻剂浓度、抗体 稀释倍数及酶标二抗各因素对竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线的影 响并就以上各影响 索设计了正交试验，摸索出了具有 较好灵敏度的检测条件。从以上结果可以看出，对包 被抗原而言，无论是商浓度的包被抗原还是低浓度的包 被抗原都是 很适合的，这是 为当包被抗原浓度低 时，包被抗原的量不足，微孔内可供抗体结合的抗原 决定簇少，从而影响灵敏度；当包被抗原浓度高时， 微孔内吸附的抗原过多，产生空间位阻，导致可供抗 体结合的有效抗原决定簇少，从而降低了灵敏度 只 有合适的包被抗原浓度，才能有最好的灵敏度（灵敏度 反映的是抗原抗体的反应亲和力，灵敏度是衡量抗体质 一掌一糌蔼最《ｓｒＴ丑冉稷 维普资讯 http://www.cqvip.com
※基 ２００６，ＶｏＬ ２７，Ｎｏ．０５ ３５ 量的又一重要指标，一般认为免疫的次数越多，抗原 和兔血清抗体与ＯＴＡ的结构类似物ＯＴＢ、ＣＴＮ未发现 抗体的反应亲和力越大， 灵敏度高，但另一方面抗 交叉反应；鸡卵黄抗体的检测灵敏度为１ ０ｎｇ／ｍｌ，兔血 体的特异性有所下降 ）。对封阻剂而言，无论是高浓 清抗体的检测灵敏度为１ｎｇ／ｍｌ。 度的封阻剂还是低浓度的封阻剂对竞争ＥＬＩＳＡ的抑制曲 ３．２ 本研究鸡卵黄抗体的最佳ＥＬＩＳＡ操作参数为：包 线的影响不大，但要求洗板洗得干净，否则亦会影响 被抗原浓度为７．５ ｇ／ｍｌ、封阻剂浓度为２．５％、抗体稀 竞争ＥＬＩＳＡ的抑制曲线。对抗体稀释倍数而言，抗体 释倍数为ｌ０００、酶标二抗稀释倍数为１４０００；兔血清抗 的稀释倍数较低时，由于抗体的浓度高，而参与竞争 体的最佳ＥＬＩＳＡ操作参数为：包被抗原浓度为２．５ ｕ ｇ／ｍｌ、 的毒素浓度相对低，导致大多数的抗体与包被抗原发生 封阻剂浓度为２．５％、抗体稀释倍数为８０００、酶标二抗 反应，从而降低了检测灵敏度：稀释倍数过火时，抗 稀释倍数为１００００。 体的浓度过低，参与竞争的毒素可能与所有的抗体发生 参考文献： 反应，导致竞争ＥＬＩＳＡ抑制曲线上抑制率达５０％以上抑 制点增多，难于判断参与竞争反应的毒素浓度，且导 Ｒｏｔｈ Ａ，Ｅｒｉａｎｉ Ｇ，Ｄｉｒｈｅｉｍｅｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆｐｕｒｅ ｏｖｅｒｐｒｏ— ｄｕｃｅｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ—ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｄｏ ｎｏｔ ｆａｖｏｕｒ ｉｔｓ 致实验莺现性不好。对酶标二抗而言，酶标二抗通常 ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｈｉｂｉｉｔｏｎ ｂｙ ｏｃｈｒａｔｉｏｎ Ａ【Ｊ］．Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉ— 有其标称的稀释倍数，但是不同的抗原抗体以及不同的 ｅａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ。１９９３，３２６：８７ ９１； 反应体系都将影响其稀释倍数，冈此本实验在使用前研 ［２】 Ｅｄｍｏｎｄ Ｅ，Ｃｒｅｐｐｙ Ｅ，Ｆｒｅｄｆｉｋ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ ｏｃｈｒａｔｉｏｎＡ，（４Ｒ）－ａ－ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｈｒａｔｏｘｉｃＡ ａｎｄ ｏｃｈｒａＢＪ￣ｃⅡ，ｏｉ１ｉｒｌｆｌ￣Ｂｎｅ 究了其最佳稀释倍数，通过研究得出其标称的稀释倍数 ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｍ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３．１０１５— 基本适宜于本实验。 １０１８． ［３】 朱培坤 免疫酶技术【Ｍ】．济南：Ｉ』』东科学出版社，１９８３ １２３．１２５． ３ 结 论 【４１ 蒋成金．酶免疫测定法【Ｍ】．北京：人民卫生出版社。１９８４．８７．８９． ［５】 余传霖，叶天星，陆德源．现代医学免艘学（第一版）【Ｍ】．』 海：上海 ３．１ 无论是鸡卵黄抗体还是兔血清抗体都有较好的特异 ［６】 医科大学出版社。１９９８．１３４．１３７， 杨利国，圳少旭，魏 毕，等酶免疫测定技术（第一版）［Ｍ】 南京：南 性和灵敏度 间接竞争ＥＬＩＳＡ分析结果表明鸡卵黄抗体 京大学出版社，１９９８．１８９．２０４． 毙 唇 日前，荷兰在老年人群中进行了一项巧克力作用的研究，结果发现每天吃三分之一条巧克力的人Ｊ０【压较低，死 危险也小。 据透露，该研究是在对１９８５年时年龄为６５周岁及以上的荷兰老人进行了长达２０多年的跟踪调查后，以收集的 数据为基础得出的结论 研究人员调查了４７０名健康男子的饮食习惯，这些人平时不服用降压片。营养师列出２４种含有可可的食物，从 巧克力棒到巧克力酱，然后分别计算出里面所含的可可量，以此来计算每个人每天所吃的可可克数。根据调查结 果，他们把受访对象分为吃很少巧克力、中等量巧克力及大量巧克力三群。吃最多的一群人约每天可可的摄取量 是４ ｇ。 他们发现，可可豆含有黄烷醇，它能改善血管的功能。吃大量巧克力的人，收缩压跟舒张压大概比不常吃巧 克力的人低了３．７和２．１ｃｍ汞柱。吃其他甜食或常抽烟喝酒的人，这个效果就不显著。而吃巧克力所伴随的高卡路 里，也没有对心脏产生影响。相反的，常吃巧克力的人，心脏冠状动脉出现疾病的几率甚至比一般人低了５０％。 那些常吃可可豆产品（比如可可饮料、巧克力条和巧克力布丁）的人血压较低，死 率也要低一半。 不过，一些研究人员认为，巧克力是否对人体健康有利现在下结论为时过早。专家指出，那些食用可可产品 的人可能是吸收了除巧克力之外其他有益健康的成分，并 过量食用巧克力会让你肥胖，导致心脏病和高血压的发 牛。
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