柱前衍生-高效毛细管电泳法分析金樱子多糖中单糖组成

陈传平;吴剑峰;方士英;陈乃东

【摘 要】采用水提-醇沉法提取金樱子多糖,经DEAE离子交换柱层析分离得单一多糖;多糖酸解后经1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化,以标准品单糖为对照,运用高效毛细管电泳(HPCE)法分析金樱子单一多糖的单糖组成.研究结果表明,所分离的金樱子单一多糖由木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖及鼠李糖组成,其物质的含量比为25.97％、17.66％、11.45％、4.12％、36.36％和3.85％. 【期刊名称】《黄山学院学报》 【年(卷),期】2018(020)003 【总页数】5页(P60-64)

【关键词】金樱子;多糖;高效毛细管电泳;单糖 【作 者】陈传平;吴剑峰;方士英;陈乃东

【作者单位】皖西卫生职业学院,安徽六安237005;皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安237012;皖西卫生职业学院,安徽六安237005;皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安237012;皖西卫生职业学院,安徽六安237005;皖西学院生物与制药工程学院,安徽六安237012 【正文语种】中 文 【中图分类】R284.1

金樱子（Rosa laevigata Michx）又称刺榆子、金壶瓶等，为蔷薇科常绿攀缘植

物金樱子的果实，在我国南方地区分布广泛[1]。作为传统中药，《本草纲目》记载金樱子“性酸、涩、平、无毒；主治脾泻下痢、止小便利、涩精气，久服，令人耐寒轻身，补血益精，有奇效”[2]。现代药理研究表明金樱子多糖是其主要活性成分之一，具有免疫调节、降血脂、抗氧化、清除自由基及抗衰老等作用[3]。多糖的活性与其一级结构及空间结构等因素有关，其单糖的组成是研究多糖的生物活性的基础[4]。高效毛细管电泳（HPCE）是上世纪80年代后期发展起来的一种分析技术[5]，具有分离效率高、快速[6]、操作简便、可选择模式多及洁净无污染等特点[7]，被广泛应用于各种活性多糖的单糖组成分析。

本试验采用水浸提、乙醇沉淀提取金樱子多糖，经离子交换柱层析法纯化，通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化-高效毛细管电泳（HPCE）分析其中主要多糖的单糖组成，为深入探讨金樱子多糖结构、进一步研究其药用价值及开发利用金樱子资源提供理论依据。 1 材料和试剂 1.1 仪器设备

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；RE-52D型旋转蒸发器（上海浦沪仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；二乙氨乙基纤维素（DEAE）-52干粉（英国Whatman公司）；FD-1型冷冻干燥机（北京博医康公司）；HL-2型恒流泵（上海精密科学仪器有限公司）；BSZ-100型自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）；TGL-18R型台式高速冷冻离心机（常州国立试验设备研究所）；7100型高效毛细管电泳仪（美国Agilent公司）等。 1.2 试剂和原料

单糖标准品：L-（+）-鼠李糖（批号：ZY130915），D-核糖 （批号：ZY130915），D-甘露糖 （批号：ZY130910），D-（+）-半乳糖（批号：

ZY130922），葡萄糖（批号：ZY13091），以上为上海紫一试剂厂提供；D-(+)-木糖（批号：C1424042，aladdin试剂公司），硼酸（天津市津北精细化工有限公司），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，SIGMA 试剂公司)，乙腈(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，三氟乙酸（TFA，色谱纯，成都西亚化工股份有限公司）；其余试剂均为AR。

野生金樱子：2015年11月采自安徽省霍山县，品种经皖西学院生物与制药工程学院相关专家鉴定为金樱子（Rosa laevigata Michx）。 2 方 法

2.1 金樱子多糖的提取

金樱子原料洗净，去籽90℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，置索氏提取器中石油醚回流脱脂（60℃，2h）后，挥干溶媒，加入适量蒸馏水，95℃回流提取3h，收集提取液得粗多糖液。 2.2 金樱子多糖的纯化

在水浴70℃下，将粗多糖提取液用旋转蒸发器减压浓缩至原体积的1/3左右，冷却至室温后，按浸提液∶H2O2=5∶1 的体积比加入 5%的 H2O2，50℃保温2h 进行脱色，再经透析[8]、Sevag 法脱蛋白[9]后，按 1:4体积比加入95%乙醇，置冰箱内（4℃）静置24h后，4000r/min离心15min，收集沉淀加适量的去离子水溶解得金樱子水溶性多糖。 2.3 金樱子多糖的分离

DEAE-52纤维素粉预处理后，湿法装柱，柱层析条件为上样量500mg，上样体积5mL，流速1.2 mL/min，先以蒸馏水平衡，再以0-2mol/L的NaCl溶液梯度洗脱[10]。洗脱液每10mL收集1管，用苯酚-硫酸法跟踪检测，依吸光度对洗脱液体积作图，收集单一主峰经蒸馏水透析48h，减压浓缩后冷冻干燥，得金樱子精制多糖。

2.4 金樱子多糖的水解 2.4.1 水解

精密称取金樱子精制多糖10mg置具塞试管中，加入 2mL0.05mol／L三氟乙酸（TFA），110℃封管水解5h后取出[11]。 2.4.2 除杂

将取出的水解液减压浓缩至干，再加甲醇3mL，蒸干，重复3次，以除尽TFA。最后加少量去离子水溶解水解产物。 2.5 金樱子多糖的柱前衍生化

取除杂后的多糖水解液按体积比加入0.3mol/L的NaOH溶液与0.5mol/L的PMP甲醇溶液（水解液∶NaOH 溶液∶PMP 溶液=2∶1∶1），混匀，70℃水浴 30分钟，取出冷却，再用0.3mol/L的HCl中和[12]。

中和后的溶液先进行第一次减压浓缩，浓缩至可见明显沉淀，用离心机进行离心（5000r/min）5 min，取其上清液用0.3mol/L的HCl调节pH至5再用等体积的氯仿萃取，并将氯仿与水的混合液一起进行离心（5000r/min）5min。反复进行3次，取其上清液用0.45um微孔滤膜过滤后，进行HPCE分析[13]。 2.6 标准单糖衍生化产物的制备

取标准单糖（木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖和鼠李糖等）用双蒸水配成标准单糖混合液，以2.5方法进行逐一衍生化后，进行HPCE分析。 2.7 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物HPCE测定

经过预实验，确定电泳条件为：硼酸缓冲液（pH 10.2：350mmol/L硼酸10mL加2mol/L NaOH 0.5mL），分离电压：20kv，检测波长：250nm。

测定：金樱子多糖水解液和单糖对照品混合溶液进行HPCE测定，记录图谱，然后再单次加入1种单糖对照品溶液混标，根据出峰时间及峰增长情况，确定金樱子多糖的单糖组成。每一样品重复进样3次，记录图谱。

3 结 果

3.1 金樱子多糖的离子交换柱层析分离结果

洗脱图谱见图1，金樱子多糖过DEAE-52分离得到3个单一峰，3个峰都出现盐洗脱部分，其中第二个为主峰，为本次单糖分析的对象。 图1 金樱子多糖在DEAE-52纤维素柱上的洗脱曲线 3个洗脱峰组份质量见表1，其中多糖总回收率为73.4%。 表1 金樱子多糖在DEAE-52纤维素柱上的层析结果? 3.2 金樱子多糖中单糖组成HPCE图谱分析

6种混合标准单糖PMP衍生物的HPCE分离图谱见图2。在优化实验条件下，各单糖PMP衍生物混合溶液进行HPCE,得到较好的分离，其流出顺序及保留时间依次为PMP 23.011min、木糖23.384 min、葡萄糖24.012min、核糖24.466min、甘露糖25.433min、半乳糖 27.209min、鼠李糖 31.577min。

图2 6种标准单糖HPCE图谱0.PMP；1.木糖；2.葡萄糖；3.核糖；4.甘露糖；5.半乳糖；6.鼠李糖

HPCE分析金樱子多糖的单糖组成结果见图3-图9，其中第一个峰为PMP，对比标准单糖保留时间（图3）及内标，各峰通过加入相应的单糖后峰增长，且出峰时间相同，从而可确定金樱子多糖的单糖组成。

金樱子多糖的单糖组成HPCE检测结果见图3。通过对比保留时间，发现木糖的保留时间与图2中单糖峰1相近，金樱子多糖木糖混标图谱结果表明（图4），单糖峰1峰高和峰面积相对其它显著增高，因此，图中单糖峰1为木糖峰。同样的方法，可以判定图3中的单糖峰1-峰6依次为：葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖（图4-图9）。综上所述，确定金樱子多糖中含有木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖，与已有报道有部分差异[14]。 图3 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物HPCE图谱

图4 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物与木糖混标HPCE图谱 图5 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物与葡萄糖混标HPCE图谱 图6 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物与核糖混标HPCE图谱 图7 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物与甘露糖混标HPCE图谱 图8 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物与半乳糖混标HPCE图谱 图9 金樱子多糖的单糖PMP衍生化产物与鼠李糖混标HPCE图谱 3.3 金樱子多糖中单糖比例测定结果

从图3可知，金樱子多糖中单糖主要有木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖及鼠李糖，通过各峰面积比较，可得物质的含量比为：木糖25.97%，葡萄糖17.66%，核糖11.45%，甘露糖4.12%，半乳糖36.36%，鼠李糖3.85%。可见金樱子多糖是杂多糖。 4 讨论

多糖的HPCE分析中，由于单糖在水溶液中解离能力差，只有强碱性条件下才能带上电荷。使用含硼砂的缓冲液能让单糖在较低的pH条件下带上足够的负电荷，不同的单糖在相同介质条件下与硼砂的络合物具有有效淌度的差异，可被毛细管电泳分辨[15]。用毛细管电泳分析多糖所含单糖的谱图，与标准单糖的谱图对照，即可得出多糖中单糖的种类与含量。对粗多糖的纯化能有效地排除其它物质对实验结果的干扰，TFA对多糖进行水解能够更加彻底，同时也为衍生化后HPCE法分析单糖组成获得准确结果提供了保障。但高浓度的TFA会破坏一部分单糖的结构，最终导致不能检测到多糖中所有的单糖，而浓度过低又会使得多糖不能完全水解，只能检测到部分单糖 [16]。经预备实验，确定了采用0.05mol/L TFA的浓度能尽可能使金樱子多糖完全水解成单糖且结构不被破坏。

HPCE分析法操作方便、精度高，同时可从图谱上比较直观地了解多糖的单糖组成及比例，但受到目前我们对多糖和单糖的认知程度以及单糖标准样品数量的限制，

也可能存在某种因没有使用的标准单糖，或者某些单糖在某一操作环节中与实验试剂发生化学反应而转变成其他物质，造成未能被检测到的问题，课题组将在以后研究中继续探索。 参考文献：

[1]王晓静，张丽，陈莉华，等.湘西野生金樱子多糖的抗氧化活性分析[J].药物分析杂志，2016，36（3）:438-443.

[2]吴玉兰，曹运长.中药金樱子的化学成分及其药理作用研究进展[J].微量元素与健康研究，2012，29（1）:53-56.

[3]吴兴文，高品一，李玲芝，等.中药金樱子的化学成分研究[J].药学实践杂志，2009，27（3）:183-185.

[4]Honda S，Akao E，Su-Uzki S，et a1．High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet-absorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives[J]．Analytical Biochemistry，1989，180（2）:351-357． [5]贾国惠．糖类的高效毛细管电泳分析[J].中国医院药学杂志，2003，23（8）:492-493.

[6]GrillE，HuberC，OefnerP，eta1．Capillary zone elec －trophoresis of paminobenzoic acid derivatives of aldoses，ketoses and uronic acids[J].Electrophoresis，1993，14（1）:1004-1010.

[7]Oefner PJ，Vorndran AE，Grill E，et a1．Capillary zone electrophoretic analysis of carbohydrates by direct and indirect UV detection[J].Chromatographia，1992，34（5-8）:308-316.

[8]刘婷，周光明.多糖的提取和分析方法 [J].化工时刊，2008，22（3):66-70． [9]吴敬铭.岩藻多糖的来源及其制备方法[J].医药化工，2008（1）:33-35．

[10]孙晓雪，康杰，王昶，等.DEAE纤维素纯化玉米须总多糖的工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（15):28-30.

[11]张海英，凌建亚，吕鹏，等.毛细管区带电泳定性分析蒙山九州虫草菌丝体和发酵液多糖水解液组分[J].复旦学报:医学版，2007，34（3）:446-448.

[12]马晓丽，孟磊，孙莲，等.大蒜多糖中单糖组分的毛细管电泳研究[J].时珍国医国药，2010，21（5）:1259-1260.

[13]季宇彬，陈学军，汲晨峰，等.芦笋多糖提取、单糖组分分析及定量测定[J].中草药，2006，37（8）:1159-1161.

[14]张庭廷，李蜀萍，聂刘旺.金樱子多糖的分离纯化及组成分析[J].生物学杂志，2002，18（3）:27-29.

[15]付昆，叶强.高效毛细管电泳法分析附子多糖中单糖组分[J].中国药业，2014，23（13）:17-19.

[16]马海宁，华玉娟，屠春燕，等.毛细管电泳法分析藏红花植物细胞多糖中单糖组成[J].色谱，2012，30（3）:304-308.