利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产菌株

利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产菌株

作者：廖海兵等

来源：《农业与技术》2015年第02期

摘 要：如何筛选赤霉素高产菌株一直是热门的研究课题。本文概述了制霉菌素抗性筛选的原理，以藤仓赤霉菌978#为出发菌株，对其单细胞悬液进行紫外和亚硝基胍（UV-NTG）复合诱变处理，将制霉菌素抗性作为筛选标记，经过初筛、复筛，就可筛选得到菌株遗传稳定性、具有更高产量的突变菌株。可以得出：利用制霉菌素抗性筛选是一种有效获得赤霉素高产菌株的方式。

关键词：制霉菌素；赤霉素；高产菌株 中图分类号：TQ920 文献标识码：A 引 言

赤霉素是5大植物激素之一，能有效刺激植物的生长发育。目前，具有商业价值的赤霉素，其工业化生产大都是经过藤仓赤霉菌的深层液化发酵而获得的。 1 制霉菌素抗性筛选的原理

定向筛选赤霉素高产菌株的关键是能否寻找出合适的筛选标记。Giordano Walter等的研究发现赤霉素的合成与固醇的合成不在同一细胞器上。制霉菌素是一种抗真菌抗生素，作用位点是真菌细胞膜上的麦角固醇，能选择性地与之结合形成通孔，提高细胞膜的通透性，进而有效抑制真菌的活动，致使细胞质发生外漏死亡。赵凯等通过采用制霉菌素培养皿成功筛选出了紫杉醇的高产突变菌株。因此，将制霉菌素抗性作为筛选标记，诱变处理后能够筛选出耐受一定制霉菌素浓度的赤霉菌突变菌株。同时，突变菌株比原始菌株的产赤霉素能力有了很大的提高，还具备稳定的高产遗传性状，各方面基本符合作为工厂生产菌株的要求。 2 试验方法介绍

以藤仓赤霉菌978#为出发菌株，进行种子培养、摇瓶发酵培养、赤霉菌细胞悬液的制备，然后对其进行诱变处理，突变株初筛及复筛，测定菌株遗传稳定性。 2.1 诱变处理

在试验中，对赤霉菌株单细胞悬液进行紫外和亚硝基胍（UV-NTG）复合诱变处理。多次研究发现，复合诱变处理比单一诱变效果更优越。

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UV-NTG诱变处理的原理。紫外线诱变处理的应用最为广泛，处理效果直接。DNA分子强烈吸收紫外线后，双链断裂并发生嘧啶水合作用，形成胸腺嘧啶二聚体；亚硝基肌（NTG）也是应用广泛的诱变剂之一，直接与核酸酶碱基作用，使DNA分子发生烷化作用，改变了DNA分子结构。

最佳诱变剂量的选择。基于细胞低致死率出现时，正突变机率较高这一经验。经过对UV和NTG设置一系列不同梯度的处理剂量，以得到较高的正向突变率为目的，将菌株致死率控制在70%左右，就能确定这2种诱变剂的最佳处理剂量。

在培养皿上涂布培养，对赤霉菌细胞悬液进行15～100s的紫外线诱变处理。通过对不同照射时间的诱变处理前后的菌落计数可以发现，当紫外线照射时间为45s时，正突变率高达20%，此时致死率为70%，因此选择紫外线照射时间为45s。以致死率和正突变率为指标，NTG的处理浓度固定，诱变剂量的自变量为处理时间。采用3.0mg/mL NTG进行处理，当30min时，菌体致死率可达75%，同时正突变率也最大，因此，选定NTG处理30min为适宜的诱变剂量。

在试验的诱变处理中，赤霉菌单细胞悬液经过3.0mg/mL的NTG诱变处理30min后，进行磁力搅拌，再用30W的紫外线灯，在灯与培养皿距离为30cm的条件下，进行照射处理45s，完成复合诱变处理。 2.2 抗性突变株筛选 2.2.1 初筛

将诱变处理后的赤霉菌单细胞悬液进行一系列不同梯度稀释，并分别涂布在含致死浓度的制霉菌素PDA培养皿上和不含任何抗生素的培养皿上。28℃恒温培养3～5d，进行初筛操作。符合要求的单菌落标准为：能够在PDA培养皿上生长、菌落直径较大、无色素；淘汰掉那些直径偏小、生长速度小、易老化、菌丝稀薄的菌落。 2.2.2 复筛

将初筛选出的菌落接种于种子培养基上，制备成种子液，以一定的接种量转接于发酵摇瓶内，恒温培养8～9d，测定瓶内赤霉素含量。与出发菌株的产量进行对照，将产量高于出发菌株5%的菌株作为正突变菌株进行保存。 2.3 高产菌株的遗传稳定性测定

在PDA斜面上，使复筛后得到高产菌株连续传代培养15次。在每次传代过程中，都需要在发酵培养基中培养测定产生赤霉素的含量。以一代菌株发酵产生赤霉素含量为标准，其他各代产生的量与之对比，测定菌株遗传稳定性。可以发现，传代后的菌株产赤霉素能力没有太大

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差异，15代后产赤霉素量明显高于出发菌株，所以利用制霉菌素抗性筛选赤霉素高产菌株具有良好的遗传稳定性，是比较理想的赤霉素高产菌株。 3 结束语

以制霉菌素抗性作为筛选赤霉素高产菌株的新标记，经过诱变处理和摇瓶复筛后，可以获得遗传性稳定、产量高的赤霉素菌株，得出制霉菌素抗性筛选确实是一种有效获得赤霉素高产菌株的方式，应进一步研究、完善。另外，除了制霉菌素抗性筛选外，还有氯霉素、特比萘芬抗性筛选等方式，应不断试验、对比，以期寻找最佳筛选标记，更有效获得遗传性状稳定的赤霉素高产菌株的方式。