Th17、Treg细胞及其相关细胞因子对溃疡性结肠炎发病的影响

影响

陈孝国;王荣芋;施培华

【摘 要】目的:研究Th17、Treg细胞及其相关细胞因子对溃疡性结肠炎发病的影响.方法:选取2013年6月~2016年7月在同济医院消化内科明确诊断为溃疡性结肠炎患者78例为病例组,选择同期因腹痛、腹泻或体质量减轻在消化内科经胃肠镜等相关检查排除消化道器质性病变的患者52例为对照组,采用流式细胞仪检测2组患者外周血中Th17、Treg细胞的比例,采用ELISA法检测2组患者外周血中IL-17、IL-10的表达水平.结果:病例组患者外周血中Th17细胞比例较对照组升高,Treg细胞比例较对照组降低,同时Th17/Treg比值较对照组升高(P<0.05);随着病情的加重,病例组患者Th17细胞在外周血中的比例逐渐升高,Treg细胞在外周血中的比例逐渐降低,Th17/Treg比值也逐渐升高(P<0.05);IL-17在外周血中的水平逐渐升高(P<0.05),而IL-10在外周血中的水平逐渐降低(P<0.05).病例组患者外周血中IL-17水平较对照组升高,IL-10水平较对照组降低(P<0.05).结论:溃疡性结肠炎患者中存在Th17、Treg细胞比例失衡,这可能是溃疡性结肠炎发病的免疫原因之一,维持Th17/Treg细胞的平衡,是防止溃疡性结肠炎发生的途径之一. 【期刊名称】《皖南医学院学报》 【年(卷),期】2018(037)004 【总页数】4页(P325-327,331)

【关键词】溃疡性结肠炎;Th17细胞;Treg细胞;白介素17;白介素10 【作 者】陈孝国;王荣芋;施培华

【作者单位】同济大学医学院 内科学教研室,上海 200092;同济大学附属同济医院分院 内科,上海 200092;同济大学附属同济医院分院 内科,上海 200092;同济大学附属同济医院分院 内科,上海 200092 【正文语种】中 文 【中图分类】R574.62

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是病变在结肠及直肠的慢性非特异性炎症性疾病，与克罗恩病(crohn disease，CD)同属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，其病程迁延，累及多系统病变，并发症较多，反复的慢性炎症刺激常较快进展为结直肠恶性肿瘤。UC的发病率在欧美国家较高，亚洲和中东地区较低，但近年来亚洲等地发病率呈逐渐上升趋势[1]。目前关于UC发病机制考虑系结肠黏膜上皮细胞分泌异常黏液糖蛋白，导致肠道黏膜的通透性发生改变，抗原进入肠黏膜，发生免疫反应及炎症变化，进一步产生抗体、细胞因子、炎症介质和氧自由基，但最终发病原因、发病机制尚不明确。越来越多的研究证实肠道黏膜免疫系统发生异常改变是导致UC发病的重要因素，本研究通过对UC患者外周血液中Th17、Treg细胞及其相关细胞因子的分析，探讨其对UC发病的影响。 1 资料与方法

1.1 一般资料 经我院伦理委员会同意，选择2013年6月～2016年7月在同济医院消化内科诊断明确为UC患者78例为病例组，男性 45例，女性 33例，年龄25～65岁，平均(35.2±0.6)岁，均否认有家族史，根据黏膜活检病理组织学检查[2]分为活动期65例，缓解期13例；活动期UC患者中按临床严重度分级[2]：轻度25例，中度23例，重度17例。以同期因腹痛、腹泻或体质量减轻在消化内科经胃肠镜等相关检查排除消化道器质性病变的患者52例为对照组，男性31例，

女性21例，年龄25～65岁，平均(33.5±0.8)岁。2组患者性别、年龄、体质量等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。所有入选患者均对本研究知情并签署知情同意书。 1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准 诊断标准按照2012年中华医学会《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见》[2]制定：在排除感染性和其他非感染性原因引起的结肠炎的基础上，按下列要点诊断：①具有典型临床表现者为临床疑诊；②同时具备结肠镜和(或)放射影像特征者，可临床拟诊；③如再加上结肠镜下黏膜活检和(或)手术切除标本组织病理学特征者，可以确诊。

1.2.2 排除标准 ①既往有恶性肿瘤病史；②起病时已合并存在感染性疾病；③起病时已合并存在自身免疫性疾病；④起病前6个月内接受过免疫调节治疗；⑤妊娠期、哺乳期以及计划妊娠的患者；⑥既往已知血液疾病或正在使用骨髓抑制和(或)刺激药物；⑦存在肝、肾功能不全；⑧起病前12个月内曾经有输血史；⑨起病前两周发生过严重外伤或接受手术治疗；⑩严重的精神心理疾病史。

1.3 仪器和试剂 流式细胞仪(LSR Ⅱ)购自美国BD公司；酶标仪(Multiskan FC)购自美国赛默飞世尔公司。FITC-CD4抗体、PE-IL-17A抗体、Foxp3-APC抗体及ELISA试剂盒均购自美国 R&D 公司，磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自美国Gibco公司，白细胞活化混合物(activation cocktail)购自美国BD公司。

1.4 Th17、Treg细胞检测 2组患者均采取空腹静脉血标本10 mL，用密度梯度离心法采集外周血单个核细胞(PBMCs)，血清储存在-80 ℃冰箱备用。 1.4.1 Th17细胞检测 被分离的PBMCs用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次，取1×106细胞/mL的浓度放在完全培养基上，用2 mL白细胞活化混合物(activation cocktail)维持37 ℃在5% CO2培养箱中刺激4 h，PBS冲洗两次，弃去上清液，剩余部分加入FITC-CD4抗体避光孵育30 min，加入固定/破膜工作

液，30 min后加入PE-IL-17A抗体再次孵育30 min，之后加入PBS，1500 r/min离心5 min，弃除上清，最后加入少许PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测标记CD4+IL-17的Th17细胞。

1.4.2 Treg细胞检测 采用与检测Th17细胞相同的方法，但在加入固定/破膜工作液30 min后改加入Foxp3-APC抗体再次避光孵育45 min，余步骤相同，最后用流式细胞仪检测标记CD4+ Foxp3的Treg细胞。

1.5 血清IL-17、IL-10检测 采用前序步骤留下的患者血清标本，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪 450 nm 波长处测定光密度值(OD值)，以标准品浓度为横坐标，所对应的 OD 值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线根据血清样品的 OD 值计算 IL-17和IL-10的表达水平。

1.6 统计学方法 所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，多组样本均数比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 2组患者外周血PBMCs中Th17、Treg细胞比例 Th17细胞在病例组患者外周血中比例较对照组升高(P<0.05)，而Treg细胞在病例组患者外周血中比例较对照组降低(P<0.05)，同时病例组患者Th17/Treg比值也高于对照组(P<0.05)；随着病情的加重，病例组患者Th17细胞在外周血中的比例逐渐升高(P<0.05)，Treg细胞在外周血中的比例逐渐降低(P<0.05)，Th17/Treg比值也逐渐升高(P<0.05)，见表1。

表1 2组患者外周血PBMCs中Th17、Treg细胞比例

组别nTh17细胞/%Treg细胞/%Th17/Treg对照组523.86±0.67 1.31±0.75 3.48±1.13 病例组 缓解期组136.59±1.710.91±0.267.97±2.77 活动期组65 轻度组 257.52±2.570.86±0.258.76±1.84 中度组 238.24±2.570.82±0.1610.20±3.08 重度组

179.74±1.960.69±0.2012.10±3.23F29.937.5121.18P<0.05<0.05<0.05 2.2 2组患者外周血中IL-17、IL-10的表达水平 病例组患者外周血中IL-17水平较对照组升高(P<0.05)，而IL-10水平较对照组降低(P<0.05)；随着病情的加重，病例组患者IL-17在外周血中的水平逐渐升高(P<0.05)，而IL-10在外周血中的水平逐渐降低(P<0.05)，见表2。

表2 2组患者外周血中IL-17、IL-10的表达水平

组别nIL-17IL-10对照组526.16±2.0929.98±9.09病例组 缓解期组

1313.19±2.4319.38±2.75 活动期组65 轻度组 2514.20±2.8818.94±2.01 中度组2316.05±2.4117.52±3.61 重度组1717.03±2.7215.35±3.51 F114.2830.62P<0.05<0.05 3 讨论

UC的病因尚未明确，有关研究显示其与肠道黏膜免疫系统异常、环境因素、遗传易感性、肠道微生物等因素有关，肠道黏膜免疫系统在维持肠道黏膜环境稳态中起着非常重要的作用，CD4+T细胞是其不可或缺的组成部分，而Th17、Treg细胞是CD4+T细胞在不同抗原的刺激下分化而成的不同亚群。

本研究结果显示，病例组患者外周血中Th17细胞比例和IL-17水平较对照组升高，Treg细胞比例和IL-10水平较对照组降低，随着病情的加重，病例组患者外周血中Th17细胞比例和IL-17水平逐渐升高，而Treg细胞比例和IL-10水平逐渐降低，这些结果与有关报道相似[3-5]。

Th17细胞是由原始CD4+T 细胞在白介素6(IL-6)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的刺激下分化而成的辅助性T细胞，多方研究已证实Th17 细胞与人体慢性炎性反应、恶性肿瘤和多种自身免疫性疾病的发病有密切联系[6-8]。Th17细胞分泌的IL-17被认为是诱导炎症反应的关键细胞因子，参与炎症发生和宿主防御细菌感染，从而导致组织浸润和损伤[9]。

Treg细胞是一类具有免疫调节功能的T细胞亚群，能保持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态，分为自然调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)和适应性调节性T细胞(Trl和Th3细胞)[10]。CD4+CD25+Treg是Treg分型中最重要的亚型，主要通过抑制机体对其体内的各种抗原的免疫应答来诱导免疫耐受，从而抑制免疫性疾病的发生。在机体炎性反应中，随着树突状细胞、单核/巨噬细胞等抗原提呈细胞的活化，CD4+CD25+Treg细胞迅速转移至炎性反应部位，在与上述抗原提呈细胞结合后活化，并抑制转移至该部位的自身反应性T细胞的功能，从而维持自身的免疫平衡状态[11]。Tr1细胞分泌的IL-10能减少IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的产生，从而对T细胞介导的免疫反应起抑制作用[12]。 Th17细胞与Treg细胞在分化过程中有着密切的联系，在人体稳态情况下，内源性TGF-β能够诱导Treg细胞的分化，从而抑制炎症反应的发生，并防止自身免疫性疾病的产生；在细菌入侵人体使肠道上皮细胞出现病变时，炎症因子可以刺激树突状细胞，使其成熟和产生IL-6，并上调转录因子RORγt，诱导IL-23R表达，从而促进 Th17细胞分化，产生IL-17[13]，使中性粒细胞募集到肠道，同时刺激成纤维细胞、巨噬细胞等，诱导产生多种促炎性细胞因子，从而导致肠道的炎症反应，而随着IL-6的升高，TGF-β可以上调转录因子Foxp3，促进Treg细胞生成从而抑制效应T细胞过度的炎症反应。

Treg细胞数量的减少和功能的减弱会导致CD4+T细胞向Th17细胞的分化，Th17细胞的比例增加和功能亢进，进一步增加炎症细胞因子的分泌，从而导致炎症反应的发生[14]。Th17 细胞数目的增多提高了血清中IL-17的浓度，而Treg 细胞数目的减少降低了血清中 IL-10 与 TGF-β的浓度，自身反应性T细胞被激活，抑制性免疫细胞因子减少，这些变化导致了UC患者肠道黏膜炎症反应的加重[15]。由此可以看出，无论UC患者体内Th17细胞的增多，还是Treg细胞的减少，我们都必须维持Th17/Treg细胞的平衡，这也是防止UC发病的途径之一，我们也

可以通过各种手段来合适配比Treg/Th17细胞,以期找到治疗UC的新方法，但人体是一个复杂多变的系统，还有很多需要解决的问题，我们仍将深入研究，为UC的预防和治疗提供新的思路。 【参考文献】

【相关文献】

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