大鼠肺缺血再灌注损伤中阿米洛利的作用机制分析

中国当代医药2018年3月第25卷第8期窑论著窑大鼠肺缺血再灌注损伤中阿米洛利的作用机制分析刘伟存河北省唐山市开滦总医院呼吸科袁河北唐山063000[摘要]目的探讨大鼠肺缺血再灌注损伤中阿米洛利的作用机制遥方法选择雄性实验大鼠72只作为研究对象袁随机分成三组袁每组24只袁分别为IR组渊缺血再灌注冤尧假手术组渊C组冤尧阿米洛利组渊A组冤袁分别在缺血45min尧再灌注60min和120min3个不同时点将各组实验大鼠麻醉处死后取血浆和右肺组织袁并对其进行检测遥结果IR组再灌注60尧120min时袁丙二醛渊MDA冤尧凋亡指数渊AI冤较假手术组均有明显升高袁阿米洛利组在给予药物后袁MDA尧AI与IR组比较均有明显降低渊P约0.05冤遥与假手术组相比袁IR组各个时点的肺组织湿/干质量比渊W/D冤和髓过氧化物酶渊MPO冤活性均显著增高渊P约0.05冤袁而阿米洛利给药后肺组织W/D和MPO活性则显著降低遥结论阿成抑制中性粒细胞浸润和减少细胞凋亡的目的遥[中图分类号]R332[文献标识码]A米洛利对肺缺血再灌注损伤具有很强的保护作用袁这可能是通过减少钙离子袁从而清除体内过量的氧自由基袁达[关键词]肺缺血再灌注损伤曰阿米洛利曰氧自由基[文章编号]1674-4721渊2018冤3渊b冤-0021-03AnalysisonmechanismofeffectsofAmilorideonratswithpulmonaryis鄄chemiareperfusioninjuryLIUWei-cunDepartmentofRespiration,KailuanGeneralHospitalofTangshanCityinHebeiProvince,Tangshan063000,China[Abstract]ObjectiveToexplorethemechanismofeffectsofAmilorideonratswithpulmonaryischemiareperfusioninjury.MethodsSeventy-twoexperimentalmaleratswereselectedandrandomlydividedintotheIRgroup(theis鄄After45minischemia,60minreperfusionand120min,ratsineachgroupwereanesthetizedandkilled,thenplasmaanddex(AI)intheIRgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup.TheAmiloridegroupwasgiv鄄endrugs,MDAandAIweresignificantlylower,comparedwiththeIRgroup(P约0.05).Comparedwiththeshamoperationsignificantly.ConclusionAmilorideonlungischemiareperfusioninjuryhasastrongprotectiveeffect,thismaybebyre鄄reducecellapoptosisofpurpose.[Keywords]Lungischemia-reperfusioninjury;Amiloride;Oxygenfreeradicalschemiareperfusiongroup),theshamoperationgroup(groupC)andtheAmiloridegroup(groupA),24ratsineachgroup.rightlungtissuesweretakenanddetected.ResultsAt60and120minreperfusion,malondialdehyde(MDA),apoptosisin鄄group,thelungwet/dryweightratio(W/D)andmyeloperoxidase(MPO)activityintheIRgroupateachtimepointweresignificantlyincreased(P约0.05),whileAmilorideafteradministration,theW/DinlungtissueandMPOactivitydecreasedducingcalciumion,soastoremovethebodyofexcessoxygenfreeradicalsandinhibitionofneutrophilinfiltrationand近几年袁由于药物和医术的精进使得患者心肺复苏尧肺栓塞和心脏转流等都得到了改善袁但是仍然有影响因素袁其中最重要的就是肺缺血再灌注损伤[1]遥阿米洛利是一种交换抑制剂袁其主要是交换Na垣/H垣袁国外很多文献中都提到了交换剂在心肌缺血再灌注损伤中的作用袁其主要作用就是能够起到抗氧化和抗炎的作用袁但在肺缺血再灌注损伤中是否有一定的保护作用目前没有相关实验和文献的印证[2]遥本研究对建立肺缺血再灌注大鼠进行模型建造袁旨在研究阿米洛利在肺缺血再灌注方面的相关作用遥1材料与方法1.1实验药品与试剂阿米洛利粉剂购自美国Sigma公司曰肝素钠注射液购自上海生物化学试剂有限公司曰丙二醛渊MDA冤试剂盒和髓过氧化物酶渊MPO冤试剂盒购自南京生物工程研究所曰戊巴比妥钠注射液购自上海试剂三厂曰凋亡检测试剂盒购自北京生物有限技术公司遥1.2实验动物与分组72只健康雄性SPF级Sprague-Dawley渊SD冤大鼠由华北理工大学实验动物中心提供袁体重180耀220g袁动物生产合格证号为SCXK冀20061026-0001795遥给予充分饲料和饮水1周后进行实验遥SD大鼠随机分为三组袁每组24只遥IR组渊缺血再灌注冤院先开胸游离右肺门袁然后进行夹闭阻隔袁之后继续完成灌注遥假手术组渊C组冤院先开胸游离右肺门后袁但是对其不进行夹闭阻隔遥阿米洛利组渊A组冤院使用5mg/渊kg窑d冤的CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.8March201821窑论著窑阿米洛利连续灌胃袁时间为1周袁1周之后进行手术袁剩余操作和IR组一致袁无区别[3]时间点内注入等量的生理盐水遥IR组和C组在相同1.3大鼠模型的建立遥选择健康的SD大鼠渊由华北理工大学实验动物中心提供冤袁腹腔注射3%戊巴比妥钠渊50mg/kg冤对其进行麻醉遥仰卧位固定袁将器官切开后进行插管袁然后连接动物呼吸机袁帮助大鼠通气袁动物呼吸机的设置要求院呼吸频率60次/min袁在经胸骨右边第3耀5肋之间开胸袁游离右肺门袁穿入手术线袁等待5min袁然后夹闭1.445标本采集及检测min袁之后建成模型[4]遥缺血45min及再灌注60min和120min后收集全血袁3000r/min离心10min取上清袁采集新鲜右肺组织1.4.1离心血清袁-80益MDA保存备用含量测定遥腹主动脉抽血3ml袁3000r/minaci袁TBAd冤10min袁1.4.2法对血清中的分离血清用硫代巴比妥酸MDA进行检测渊thiobarbituric织1g袁肺组织取得之后制备成匀浆MPO测定获取右肺上叶相同部位肺组遥袁最后把制备好的匀浆进行离心1.4.3鼠1g对肺组织湿袁离心之后取上清液用比色法测右肺中叶组织/干重比值袁使用分析天平进行称量渊W/D冤进行测定MPO遥获取大袁称量得到的质量称为湿质量袁然后将其放在70益电热恒温进行干燥袁干燥之后得到的质量称为干质量袁其中湿质量和干质量的比例是1.4.4W/D[5]右肺中叶进行固定肺组织细胞凋亡指数袁固定液选用渊AI遥冤的检测10%的甲醛溶液获取一小块袁固定之后将其使用常规石蜡进行包埋袁对大鼠右侧肺中叶的凋亡细胞进行定量检测遥对细胞进行染色袁细胞核染色之后呈现棕黄色袁也是阳性细胞袁除去细胞核之后袁还会有部分细胞质也会着色显示为黄色[6]细胞质由于细胞核DNA碎片漏出导致出现阳性着遥一些染1.4.5遥对切片进行观察溶液进行固定后再进行包埋病理检查获取一定量的组织块袁观察使用工具是切片光镜遥袁切片袁HE袁以染色10%袁的甲醛最后在光镜下观察切片的变化1.5统计学方法遥采用SPSS20.0统计学软件对数据进行分析袁计量资料以均数依标准差渊x依s冤表示袁两组间比较采用单因素方差分析渊one-wayANOVA冤袁以P约0.05为差异有统计学意义22.1结果遥血浆MDA和肺AI在不同时点的变化情况各组不同灌注时间点的MDA和AI值比较袁差异无统计学意义AI比较袁差异无统计学意义渊P跃0.05冤曰各组缺血渊P跃0.05冤遥45minIR时的组灌注MDA尧60尧22CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.8March2018中国当代医药2018年3月第25卷第8期120差异有统计学意义min时的MDA尧AI渊P约0.05冤渊明显提升表1冤遥袁且显著高于A组袁表1血浆MDA尧肺AI尧肺组织W/D和MPO活性的变化渊x依s冤组别W/DMDAMPOAIC组缺血渊n=24冤45min再灌60min4.56依0.064.66依0.053.68依0.322.18依0.29再灌120min4.74依0.053.91依0.360.73依0.043.95依0.350.82依0.060.86依0.032.31依0.31IR组渊n=24冤2.38依0.32缺血45min再灌60min4.98依0.06再灌120min6.13依0.063.89依0.316.68依0.055.65依0.410.85依0.058.52依0.370.97依0.052.45依0.41A组渊n=24冤1.18依0.0516.59依1.428.56依1.54缺血45min再灌60min4.67依0.065.31依0.043.61依0.310.76依0.04再灌120min5.65依0.064.49依0.514.7依0.650.93依0.052.38依0.34C组院手术对照组渊Control组冤曰A组院药物干预组0.97依0.05渊Amiloride11.32依1.566.54依1.42组冤2.2肺组织W/D和MPO活性在不同时点的变化情况各组内不同灌注时间点上的肺组织W/D和MPO活性比较袁差异无统计学意义渊P跃0.05冤曰在不同灌注时点袁IR组与A组的肺组织W/D和MPO活性显著高于C组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤袁且IR组的肺组织W/D和MPO活性显著高于A组袁差异有统计学意义2.3肺组织经病理学验证情况分析渊P约0.05冤渊表1冤遥正常对照组的肺组织形态无任何明显变化袁然后肺泡腔中会变得壁薄袁无充血尧水肿等情况遥缺血再灌注发生45min之后袁就会出现一些症状袁主要是血管出现充血袁血管出现充血之后袁肺泡之间会产生炎性细胞3讨论袁炎性细胞增多袁细胞的损伤程度也会加重遥肺缺血再灌注损伤的病理原因非常复杂袁目前尚不明确袁研究显示袁氧自由基增多袁钙离子量也变多袁炎症细胞也增多袁这些物质增多之后就会聚集在一起袁然后造成细胞凋亡袁这些在肺缺血再灌注损伤的发展过程中起着非常关键的作用[7]为可以主要在这几个方面进行干预袁袁因此部分学者认通过这些干预措施实验对肺缺血再灌注损伤的保护[8]器官缺血出现再灌注损伤的重要因素是出现氧遥自由基袁氧自由基可以分解患者体内细胞间质的酶和胶原袁使得组织器官受到极大损伤袁MDA是氧自由基在攻击其他组织时产生的产物[9]定到体内氧化负电荷的大小袁是判断产生氧自由基和袁其含量可以直接决组织受到损伤的主要指标袁在实验过程中也能观察到遥在IR组中袁灌注时间越长袁LVIDA值越大袁提示肺缺血再灌注损伤出现在体内能够破坏氧自由基袁使得中国当代医药2018年3月第25卷第8期氧自由基平衡彻底被破坏袁增加氧自由基袁诱发肺水肿和出血症遥注射阿米洛利之后袁MDA虽然也增多袁但是增加的幅度没有IR组大袁其降低效果也比较明显袁提示阿米洛利具有很强的抗氧化能力袁抑制自由基产生袁减少肺缺血再灌注损伤遥肺缺血再灌注损伤情况的出现和继续发展与中性粒细胞的激活和聚集有着非常紧密的联系[10]这种情况之后袁经过呼吸作用释放出极多的氧自由基遥出现和蛋白水解酶袁出现的蛋白水解酶会损伤肺血管组织和肺血管组织周围的器官袁使得肺泡中的上皮细胞受到损伤遥MPO是一种特异性酶袁而且还是一种中性粒细胞袁其含量可以用中性粒细胞来测定遥实验结果显示袁注射阿米洛利之后袁MPO量明显降低袁提示注射阿米洛利能够有效减弱肺缺血再灌注损伤时中性粒细胞的聚集情况遥文献显示袁细胞凋亡情况主要和缺血灌注损伤有关系袁当处于肺缺血再灌注损伤情况下袁患者体内会快速出现大量的氧自由基和钙离子袁这两种物质增加袁细胞凋亡情况就会加重[11]血情况出现多于30min时袁IR遥本研究结果显示组与C组比较袁袁在缺差异无统计学意义曰随着灌注时间的延长袁IR组内AI会快速增长袁2h达到最高值袁这一结果和国内相关报道的内容一致IR遥本研究结果还显示袁A组也升高袁肺缺血再灌注损伤组比较袁数值还是比较低袁减轻细胞凋亡情况袁提示阿米洛利能够抑制但是和袁减少患者损伤情况遥渊NaNa垣/H垣交换体属于一种抑制交换体袁也称为NHE垣/H垣作用袁表明在患者处于一种缺血状态时exchanger冤袁在缺血灌注中体现出了阳离子的袁患者体内的酸中毒情况会逐渐加重袁随机NHE也会被激活[12]是在血液转运过程中却因为细胞出现酸中毒情况而遥但被抑制发展袁当再次灌注之后袁患者体内的血流会恢复正常袁细胞中毒情况也会得到改善袁纠正细胞内酸中毒袁而且还能聚集钠离子[13]减少袁Na泵不能排除钠离子袁使得遥这是因为Na垣转出钠离子的同时还会摄入钙离子/Ca2垣ATP交换体从反量开始方向开始转出袁袁使得钙超量袁由此造成了氧自由基增多尧出现多种炎症反应和患者体内细胞凋亡情况袁从而加重了患者的病症遥阿米洛利是一种抑制剂袁属于Na垣主要作用是推测患者体内的氧自由基是否得到抑/H垣交换抑制剂袁制袁患者细胞凋亡情况是否得到改善[14]目前评价肺水含量和微血管损伤的治疗是肺组遥织W/D袁本研究主要是对IR组灌入W/D袁灌入之后其性能还是非常高袁提示阿米洛利对于干预患者体内的病症是非常有作用的曰同时袁也在检查的切片中观察到患者注射阿米洛利之后肺水肿和体内炎症的变化窑论著窑情况袁和IR组比较袁患者的症状得到了明显的改善袁提示阿米洛利的作用是清除患者体内的氧自由基袁从而从根本减少患者体内的中性粒细胞[15]综上所述袁阿米洛利对肺缺血再灌注损伤有着很遥强的保护作用袁这可能与其抑制作用有关袁由此来减少钙离子袁继而减少人体内分解出的氧自由基袁实现抑制患者体内中性颗粒细胞的浸润和减少人体内细胞的凋亡遥[1]杜旭升细胞凋亡的影响袁白洁袁李建英袁等[参考文献.阿米洛利对肺缺血再灌注损伤大鼠][2]蔡燚袁李庆节袁林爽[J].袁陕西医学杂志等.阿米洛利与白藜芦醇对肝缺血再袁2014袁43渊6冤院656-658.[3]561-563.灌注损伤的保护作用[J].临床和实验医学杂志袁2010袁9渊8冤院王峰袁王培袁卢才义袁等.Na垣/H垣交换阻滞剂对离体鼠心缺[4]张三妹渊1冤院9-12.血后再灌注损伤的保护作用[J].空军总医院学报袁1993袁9实验研究.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的[5]杜旭升.阿米洛利对大鼠肺脏缺血再灌注损伤保护作用[D].太原院山西医科大学袁2008.[6]的研究[D].太原院山西医科大学袁2008.[7]石家庄李雪卿杜旭升院.阿米洛利对大鼠全脑缺血伤的保护作用袁河北医科大学赵卉袁[J].李建强中国药物与临床.袁2008./再灌注损伤的影响[D].阿米洛利对大鼠肺缺血再灌注损[8]张三妹袁李光来.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤后袁2008袁8渊2冤院100-102.[9]张三妹186-188.ATP酶的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志袁2008袁6渊2冤院体SDH袁李光来的影响.[J].阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤后线粒[10]胡若愚袁邵宏涛袁临床医药实践杂志董国华袁等.阿米洛利同系物对老龄大袁2008袁4渊1冤院17-19.[11]朱万琴2007袁6渊1冤院40-43.鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].实用医学杂志袁注心肌的影响袁柳松.阿米洛利同系物和心肌缺血预处理对再灌[12]王红杰袁马青袁张达仁[J].中国医科大学学报袁等.Na袁2002袁3渊3冤院45-46.垣肌缺血/再灌注损伤的保护作用/H垣交换抑制剂对离体鼠心4渊4冤院36-39.[J].中华麻醉学杂志袁2000袁[13]程岚403-404.伤心肌的保护作用袁姚伟星袁夏国瑾[J]..同济医科大学学报阿米洛利对大鼠缺血袁1998袁23渊5冤院-再灌注损[14]王峰心缺血后再灌注损伤的保护作用袁卢才义袁刘宣力袁等.Na垣-H垣交换阻滞剂对离体鼠1993袁7渊3冤院63-66.[J].中国病理生理杂志袁[15]莫显刚24渊3冤院234-238.鼠巨噬细胞袁王兰袁ABCA1洪伟袁等的降解.阿米洛利抑制载脂蛋白[J].中国动脉硬化杂志A1诱导小袁2016袁渊收稿日期院2017-12-15本文编辑院祁海文冤CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.8March201823