HBV耐药性及其防治策略

南昌市第九医院 徐龙

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus , HBV) 是目前世界上流行最广泛的病毒之一， HBV有较高的变异性，其原因是由于HBV的复制是通过RNA中间体（前基因组RNA）利用病毒本身的DNA多聚酶（polymerase）─DNA-P反转录成负链DNA，在反转录过程中，DNA-P缺乏校对酶活性，不能修正核苷酸的错配，导致HBVDNA序列发生变异。HBVDNA至少含有4个开放读码框(open-reading frames，ORF)，即S区(包括S区、前S1区和前S2区)、C区(包括C区和前C区)、P区和X区。本文就HBV耐药及防治策略的最新研究进展作一综述。

一、HBV 分子结构及复制周期

HBV属于嗜肝DNA 病毒, 其基因全长仅3. 2 kb。在HBV包膜内, HBV 基因以不完全双链环状DNA 形式存在。HBV 感染人体肝细胞后,将包膜内HBV DNA 释放入肝细胞核内并形

成共价闭合环状DNA(cccDNA) 。宿主RNA 聚合酶以cccDNA为模板,转录成mRNA。mRNA 亦为前基因组RNA。HBV 多聚酶以前基因组RNA为模板,逆转录合成负链HBVDNA ,然后再以负链DNA 为模板合成正链HBV DNA。最终形成子代HBV DNA。由此可见, HBV 多聚酶在HBV 复制过程中起着至关重要的作用。

二、HBV 耐药突变的定义及命名

病毒对抗病毒药物的耐药分为表型耐药和基因型耐药。表型耐药是指：在治疗期间病毒水平上升，一般用抗病毒药物浓度（IC50）测定，IC50增加说明药物敏感性下降或耐药程度增加，需要更大的药物剂量才能抑制变异的病毒。基因型耐药是指病毒聚合酶基因突变，形成新的病毒基因序列，一般采用DNA测序、基因芯片等方法测定。发生变异的病毒常可改变其生物学特性，给临床的防治带来一系列问题。针对HBV耐药可分为表型耐药、基因型耐药、临床耐药，临床耐药( clinical resistance)指临床出现病毒复制不能被抑制,或HBV 复 制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳, 同时并伴有ALT 升高。

已知核苷类药物耐药突变均发生在HBV多聚酶(DNA-P)上。HBV 分为8 个基因型(A～H) 。各基因型HBV多聚酶长短不尽相同。以A基因型HBV 为参照,HBV 多聚酶总长845 个氨基酸。HBV多聚酶可分为4 个功能区: 终端蛋白(terminal protein) 、间隔区 (spacer) 、逆转录酶区( reverse transcriptase) 及RNA 降解酶区 (RNase H) 。HBV 耐药变异以国际通行的氨基酸单字母加变异位点来标记。例如, YMDD 代表逆转录酶区的4 个氨基酸(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) ,其中的蛋氨酸(M) 变为亮氨酸(V) 或异亮氨酸( I) 则会引起拉米夫定耐药。起初,HBV 耐药突变的位置是从HBV多聚酶的第一个氨基酸数起。由于HBV 8个基因型的HBV多聚酶长短不同,以不同HBV 基因型为参照, YMDD 所处的位点不同。同样的YMDD 变异被报道成M552V、M550V、M539V 等不同命名。为避免混乱,Stuyverg 等提议将HBV 耐药突变统一从逆转录酶功能区(各基因型均为344 个氨基酸) 的第一个氨基酸数起并加前缀rt (例如YMDD 变异被命名为rtM204V) 。HBV多聚酶逆转录酶区包含7 个基因保留亚区(A～ G) 。拉米夫定耐药突变主要发生在B 和C 亚区中。HBV多聚酶逆转录酶的三维结构犹如一只半张开的右手。B 和C 亚区均位于手掌部位,紧靠拉米夫定结合位点。rtM204V 或rtM204I 突变是引起拉米夫定耐药的一个直接因素。从分子结构上讲,V 和I 均比M多了一个β甲基。而这个多出来的甲基造成拉米夫定结合位点的空间拥挤,从而使拉米夫定不能有效地与HBV多聚酶结合。

三、HBV 耐药突变的机制

由于HBV 在体内复制的过程需要经过逆转录这一步骤, 在反转录过程中，DNA-P缺乏校对酶活性，不能修正核苷酸的错配，导致HBVDNA序列发生变异，HBV 复制中的天然复制错误率比其它DNA 病毒要高10倍左右。HBV 基因在复制过程中不断产生天然变异,因而在HBV 感染者体内常形成一群由基因十分相似、但不完全等同的病毒株组成的准种(quasispecies) 。在未接受过核苷类药物治疗的患者中, HBV野型株占HBV 准种的绝大多数。耐药变异株在患者用药前就可能存在,也可在用药过程中产生。患者用药后,对药物敏感的野型病毒株受到抑制。含有耐药突变的病毒株得以有更多空间进行复制。当对某一药物有耐药性的病毒株成为准种中

的主要病毒株时,此药就失去疗效。

四、主要HBV耐药突变

治疗乙型肝炎的核苷类药物主要是通过与HBV 多聚酶的天然底物(dNTP) 竞争来达到抑制HBV多聚酶的活性,从而达到抑制HBV 复制的作用。

P基因区是HBV基因组中最大的ORF，全长2496bp，编码含832个氨基酸的多肽，称为HBVDNA多聚酶(DNAP)，位于nt2357～0～1621之间。HBV耐药株的变异发生在DNAP基因的rt区。临床研究已发现有各种不同药物的H B V 耐药变异株，根据核苷（酸）类似物耐药变异株的不同形式，可将现有的药物分为三组：（1 ）L-核苷（酸）类似物组包括拉米夫定(Lamivudine ，LMV)、依曲西他平(Emtricitabine，FTC)，替比夫定(Telbivudine，LdT)、克拉夫定（Clevudine，CLV）；（2 ）无环磷酸酯组，包括阿德福韦(adefovir dipivoxil，ADV)和替诺福韦（tenofovir，TFV）；（3）环戊烯组，包括恩替

卡韦(entecavir，ETV)等。

1. L- 核苷（酸）类似物组

DNA聚合酶C区亚结构域（motif）是HBV进行逆转录的活性部位，由酪氨酸（Y）、蛋氨酸（M）－天门冬氨酸（D）－天门冬氨酸（D）即YMDD组成，该部位正是LAM干扰HBV复制的结合位点。研究证明，YMDD中的rt204位蛋氨酸可被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）取代，生成YVDD或YIDD，导致该亚结构域的空间构型改变，从而妨碍了与LAM的结合。YIDD变异可单独存在，而YVDD则常伴有多聚酶B区rt180位的亮氨酸(L)由蛋氨酸(M)取代的变异。变异后的HBV对LAM的敏感性显著下降。与拉米夫定有关的主要耐药变异位点为rtM204I/V，目前研究已发现与耐药有关的不同类型的突变形式包括：（1 ）r t M 2 0 4 I / V +rtL180M；（2）rtM204I；（3）rtV173L +rtL180M + rtM204V；（4）r1L80I + rtM204I；（5）rtQ215S + rtM204I/V + rtL180M；（6）rtIl69T + rtV173L + rt 180M + rtM204V ；（7）rtA181T ；（8）rtT184S + rtM204I/V± rtL180M；（9）rtM204S + rtL180M，其中一部分变异是作为补偿突变可增强病毒的复制活性或耐药性，一部分变异会影响到随后的治疗选择。其他L-核苷（酸）类似物的耐药特点与拉米夫定相似，主要变异位点集中于rtM204I/V伴随有一些其他位点的变异。

2. 无环磷酸酯组

阿德福韦耐药变异位点集中于P 基因D 区rtN236T位点和（或）B区rtA181V/T，与拉米夫定耐药主要集中于rtM204位点不同，阿德福韦耐药变异位点较为分散，除了上述两个位点变异之外，还发现有rtP237H、rtN238T/D、rtV84M、rtS85A、rtQ215S及rtV214A等。由于阿德福韦耐药突变形式与拉米夫定不同，因此阿德福韦耐药患者可应用拉米夫定或其他L-核苷（酸）类似物治疗，拉米夫定耐药也可采用阿德福韦治疗。T F V 对

拉米夫定耐药毒株有效，但在同时感染H I V和H B V 的患者中发现有对T F V 及拉米夫定同时耐药的变异株，该变异点位于B区和C区结合位点rtA194T，同时出现有rtL180M+rtM204V突变。这种联合突变株对TFV药物敏感性下降10倍以上。

3. 环戊烯组

恩替卡韦耐药的突变形式主要有两种，均发生于拉米夫定耐药的患者：（1 ）rtM250V ±rtI169T + rtM204V + rtL180M，（2）rtT184G+ rtS202G/I + rtM204V + rtL180M。新近发现rtV173L变异。

五、HBV耐药的防治

1. 乙型肝炎病毒耐药变异的预测因素:

多种因素可预测HBV对核苷(酸)类似物发生耐药几率。如治疗开始时HBV DNA载量高、有肝纤维化/肝硬化基础、曾接受过核苷(酸)类似物抗病毒治疗、耐药病毒株的适应能力强均提示高耐药风险。越来越多的研究提示早期病毒学应答情况也是预测耐药发生率的重要指标。

2. 乙型肝炎病毒耐药变异的预防策略:

( 1) 合理选择核苷(酸)类似物抗病毒治疗的适应证:对免疫耐受期或非活动期HBV感染者,尤其是年龄较轻者,如不需要接受免疫抑制剂或化疗药物治疗,则不建议应用核苷(酸)类似物。

( 2) 合理选择抗病毒治疗方案:治疗方案参考中国“慢性乙型肝炎防治指南”。应密切

观察患者治疗期间病毒学的应答情况。此外,应尽量避免单药序贯治疗,以免多药物耐药的发生。

(3) 提高患者的依从性:在用核苷(酸)类似物进行抗病毒治疗期间,要反复强调遵医嘱按时、足量服药。

3. 定期监测应答情况,及时调整治疗方案:

治疗期间每3个月检测一次HBVDNA水平,如非依从性差所致,对原发性治疗失败或发生病毒学突破者要及时进行基因型耐药检测,并鉴定变异模式,以指导换用其他治疗方案。HBV DNA水平的动态变化是早期发现耐药变异的重要指标。但分析结果时需注意不同实验室和不同检测方法的敏感性有所差异。

4. 已发生耐药变异的临床处理建议:

对少数治疗前ALT正常、肝组织学检查炎症或纤维化病变轻微( < G1S1)者可停止抗病毒治疗,但需密切监测,一旦有肝炎突发,及时再抗病毒治疗;对绝大多数核苷(酸)类似物耐药者,尤其是失代偿期肝硬化患者,需及早进行挽救治疗( rescue therapy) 。通常病毒学突破先于生物

化学突破,在生物化学突破前进行挽救治疗可使患者免于发生肝炎突发、肝病恶化。挽救治疗需根据病毒对不同核苷(酸)类似物耐药特点加用或换用无交叉耐药的核苷(酸)类似物；如无禁忌证,亦可选用IFN2α或聚乙二醇化干扰素。拉米夫定耐药加用阿德福韦或换用恩替卡韦；阿德福韦耐药且拉米夫定初治患者应加用拉米夫定、或换用替比夫定或恩替卡韦 ；替比夫定耐药处理与拉米夫定基本相同；恩替卡韦耐药加用阿德福韦或换用IFNα。

六、HBV变异的检测方法

HBV变异主要的检测方法有

1. PCR扩增法：PCR扩增-限制性酶切片断多态性分析(PCR-RFLP)是目前国内实验室常用的YMDD变异、rtA181V阿德福韦酯耐药、BCP区变异位点的检测方法。实时荧光PCR扩增是近期国内应用较多的HBV耐药检测方法。

2. 基因芯片分析：包括流体芯片技术、探针杂交技术，主要通过逆向斑点杂交技术实现对变异位点的检测。

3. 焦磷酸测序法：对血清标本的重复性及可靠性检测显示，质粒标准品的突变检出率及重复率为100%，而血清标本为98.8%。

4. 基因克隆与测序：采用特异性引物对所在目的片断进行克隆后测序，通过与标准株的比较识别变异位点。这是所有检测方法中最为客观的检测方法，但操作复杂、成本高、耗时长是该方法的主要缺陷。

七、结语

自然界的任何物种都存在变异(mutation)，变异是生物适应环境和维持生存的一种重要方式，是生物进化的规律，对遗传进化起到重要的作用。HBV具有较高的复制率，据估计H B V 病毒颗粒平均每天产生量为1 012～13个，一个复制周期中每10 5个核苷出现一个错配，这样每天就有1010～11个错配发生，而大部分突变为沉默突变，无生物学意义，HBV的变异性是如此之高，以致于没有两株病毒的核苷酸序列完全相同。HBV在其感染慢

性化过程、免疫应答、疫苗接种、病毒药物治疗等因素影响下进行变异的优势选择，以实现物种生存的目的。近来的研究表明，宿主的免疫压力对HBV 基因突变的产生和选择起了重要作用。总之，HBV 变异后对乙肝诊断、治疗、预防都产生重大影响，HBV 持续感染中各ORF 发生的突变不是孤立的，可发生多位点突变。目前研究人员又成功破译了HBV 基因组新的编码基因—前—前—S 基因和前—X 基因。这样，HBV 基因组的ORF增加到6 个。除此之外，HBV 基因组还包括其他一些参与病毒复制的调控元件，包括4 个启动子，2 个增强子，包装信号ε等。因而对待HBV 变异必须从全基因组出发、用发展的眼光看侍HBV变异，从各个角度全方位分析，这样才能正确分析病情，避免临床出现漏诊，盲目用药和延误治疗现象发生，以致于患者病情加重。只有正确对待HBV 各位点的变异，才能判断抗病毒药物的选择及疾病预后，从而为患者个性化诊疗提供依据。