副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析

７３４　细胞与分子免疫学杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１）２０１３，２９（７　・论著・　文章编号：１００７—８７３８（２０１３）０７—０７３４—０５　副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析　张　蕾　，张西萌　，张海予。，魏海燕　，马　丹　，刘雪松　，曹　栋。，曾　静　（　北京出入境检验检疫局，北京１０００２６；　北京农学院，北京１０２２０６；　北京大学实验动物中心，北京１００８７１）　［摘要］　目的制备副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体（ｍＡｂ）并建立双抗夹心ＥＬＩＳＡ。方法采用差速离心法提取副溶血性　弧菌ＡＴＣＣ　１７８０２菌株的鞭毛蛋白，并以此为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，抗血清效价达到１：３２　０００时，取脾细胞与生长良好的对数　期Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞进行融合。多次克隆化培养后获得杂交瘤细胞株并制备腹水，纯化后得到抗体。结果获得６株持续、稳　定分泌抗副溶血性弧菌鞭毛蛋白ｍＡｂ的杂交瘤细胞株，命名为ＶｐＮｏ．１～ＶｐＮｏ．６，抗体效价高达１：２×１０　。对抗体进行了Ｉｇ类　和亚类检测以及Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法鉴定，其Ｉｇ亚类依次为ＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ和ＩｇＭ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示，提取出的　鞭毛蛋白相对分子质量（Ｍｒ）为４２　０００并且纯度较高。采用ＶｐＮｏ．６抗体建立了副溶血性弧菌双抗夹心ＥＬＩＳＡ，该方法的检测　灵敏度达到１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌液，通过采用１３４株副溶血性弧菌和７４株非副溶血性弧菌进行特异性实验，结果表明１３４株副溶血　性弧菌呈阳性反应，７４株非副溶血性弧菌呈阴性反应，ＶｐＮｏ．６抗体具有非常好的特异性。在基质添加试验中，最低检出限为　２１　ＣＦＵ／ｇ样品。结论成功制备了副溶血性弧菌鞭毛蛋白ｍＡｂ，并将其应用于双抗夹心ＥＬＩＳＡ，该方法的检测灵敏度达到ｌ　ｘ　１０　ＣＦＵ／ｍＬ菌液，与所测试的非副溶血性弧菌没有交叉反应。　［关键词］副溶血性弧菌；鞭毛蛋白；单克隆抗体；双抗夹心ＥＬＩＳＡ　［中图分类号］Ｒ３９２．１１，Ｒ３７８．３，Ｒ３９２－３３，Ｑ８１３．２　［文献标志码］Ａ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｉ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｃｏｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈ－　ａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｌｅｉ　一，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉｍｅｎｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｈａｉｙｕ　，ＷＥＩ　Ｈａｉｙａｎ　，ＭＡ　Ｄａｎ　，ＬＩＵ　Ｘｕｅｓｏｎｇ　，ＣＡＯ　Ｄｏｎｇ　，ＺＥＮＧ　Ｊｉｎｇ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｅｎｔｒｙ—Ｅｘｉｔ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ　Ｂｕｒｅａｕ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００２６；　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０２２０６；　。Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８７１，Ｃｈｉｎａ　ｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｊ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｐｒｅｐａｒｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｍＡｂｓ）ａｇａｉｎｓｔ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｃｏｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ（　）ｐａｒａｈａｅ—　ｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ａｎｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬｌＳＡ　ｆｏｒ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｆｒ０ｍ　ｆｏｏｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｅ）ｃ【ｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ＩＴＣＣ１７８０２　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａ－　ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ　ｆｒＯｍ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｓｐ２／０　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｌｏｇ—ｐｈａｓｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｗｈｅｎ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　１：３２　０００．Ｔｈｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｒｅｇｕｌａｒ　ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ａｓｃｉｔｅｓ．Ａｎｄ　ｍＡｂｓ　ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｔｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ａｓｃｉｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｓｉｘ　ｈｙｂｒｉｄｏ－　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ＶｐＮｏ．１一ＶｐＮｏ．６．Ｔｈｅ　ｍＡｂ　ｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ　ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｍＡｂｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｉｔｅｒ　ｊｎ　ｓｅｒｕｍ　ｂｙ　ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ　ｗａｓ　１：２　ｘ　ｌＯ。．Ｔｈｅ　ｍＡｂｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　Ｉｇ　ｃｌａｓｓｅｓ　ａｎｄ　ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｔｈｅ　Ｉｇ　ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｍＡｂｓ　ｗｅｒｅ　ＩｇＧ１，ＩｇＧ１，ＩｇＭ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ　ａｎｄ　ＩｇＭ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ（Ｍｒ）ｗａｓ　４２　０００．Ｕｓｉｎｇ　ＶｐＮｏ．６，Ｄｏｕｂｌｅ・ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ　ｗａｓ　ｓｅｔ　ｕｐ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｔｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ．ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｅｎｓｉｔＭｔｙ　ｗａｓ　１０　ＣＦＵ／ｍ　Ｌ＿Ｔｈｅ　ＥＬＩＳＡ　ｓｈｏｗｅｄ　ＶｐＮｏ．６　ｈａｄ　ａ　ｄｅｓｉｒａｂｌｅ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ａｎｄ　７４　ｎｏｎ一　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｌｏｗｅｓｔ　ｌｉｍｉｔ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｉｎ　ｔｅｓｔｉｎｇ　１３４　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　２１　ＣＦＵ／ｇ　ｓａｍｐｌｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂａｓｅ・ｍａｔｅｒｉａｌ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｆｌａｇｅｌｌｉｎ　ｃｏｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｐｒｅｐａｒｅｄ．Ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｗｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ＶｐＮｏ．６　ｍＡｂ　ｈａｄ　ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｙ　ｔａｓ　ｈｉｇｈ　ａｓ　１０　ＣＦＵ／ｍ　Ｌ＿Ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ＶｐＮｏ．６　ｗａｓ　ｈｉｇｈｌｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ．　收稿１３期：２０１２—１２—１１；接受１３期：２０１３—０３—０４　基金项目：质检总局公益项目（２０１１１００３４）；国家质检总局科技计划项目（２００９１Ｋ１８４）　作者简介：张蕾（１９８７一），女，黑龙江嫩江人，硕士研究生　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，曾静，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｅｎｇｊ＠ｂｊｃｉｑ．ｇｕｙ．ｃｎ　Ｔｅｌ：１５２０１　１９６７５２；Ｅ　ｍａｉｌ：ｚｌｅｉ０６０５＠ｙａｈｏｏ．ＣＤ　７期　张蕾，等．副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及其活性分析　７３５　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ；ｆｌａｇｅｌｌｉｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｄｏｕｂｌｅ－ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　２５９２３、鼠伤寒沙门氏菌ＣＭＣＣ　５０１１５、铜绿假单胞菌　副溶血性弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，Ｖｐ）是一　ＡＴＣＣ　５４４２、粪肠球菌ＣＧＭＣＣ　１．２１３５、副溶血性弧菌自分　种重要的食源性致病菌，分布在世界各地，通常存在　ＡＴＣＣ　１３２、霍乱弧菌自分离株１～４１和７５；蛋白质相对分　于海水浮游生物和鱼贝类中，人们多因食用污染本　离株１～１菌而又未经良好加工的海产品而引起食物中毒，症　状为腹泻、肠痉挛、呕吐等，重症患者还会脱水、休　克昏迷，甚至死亡＿ｌ　Ｊ。目前，副溶血性弧菌引起食　子质量（Ｍ　）ｍａｒｋｅｒ购自大连宝生物有限公司；Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、　ｇｌｙｅｉｎｅ、２　Ｘ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｅｌ　Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｙｅ购自上海生工生物公司；　ＴＩＮ１琼脂培养基、大豆酪蛋白琼脂培养基（ＴＳＡ）及碱性蛋白　胨水培养基（ＡＰＷ）购自北京陆桥有限责任公司。ＢＡＬＢ／ｃ雌　物中毒的发生规模以及人群暴露规模呈明显上升趋　势，已成为我国首要的食源性致病菌　Ｊ。目前检测　食品中副溶血性弧菌的方法主要以传统方法为主，　所需时间长，一般需要３—５　ｄ时间；近几年发展起　来的ＰＣＲ和实时荧光ＰＣＲ技术，具有快速、灵敏、　特异等特点，但是该技术易受食品中ＰＣＲ抑制剂的　影响，且检测结果不能直接反应食品中活菌的存在　情况。以抗体为基础的免疫学检测方法具有特异性　好、高通量（ＥＬＩＳＡ）和快速（免疫胶体金试纸条）的　特点　４］，但是免疫学检测的特异性和灵敏度依赖于　抗体的质量。副溶血性弧菌的鞭毛是重要的表面抗　原，也是主要的抗原决定因子，具有特异性的鞭毛抗　原（Ｈ抗原），常作为血清学鉴定的依据之一，具有　种特异性，是抗体制备的理想抗原。本研究旨在采　用副溶血性弧菌的鞭毛蛋白作为抗原，制备单克隆　抗体，建立副溶血性弧菌ＥＬＩＳＡ检测方法，并对制备　的单抗进行检测灵敏度和特异性的评估，为该单抗　的进一步应用奠定基础。　１材料和方法　１．１　材料　本实验所用菌株及编号如下：副溶血性弧菌　ＡＴＣＣ　１７８０２、副溶血性弧菌ＡＴＣＣ　１．１９９７、创伤弧菌ＡＴＣＣ　１７５８、河流弧菌ＡＴＣＣ　１．１６１１、拟态弧菌ＡＴＣＣ　１．１９６９、溶藻　弧菌ＡＴＣＣ　１．１６０７、溶藻弧菌ＡＴＣＣ　１８３３、费尼斯弧菌ＡＴＣＣ　１．１６１２、解蛋白弧菌ＡＴＣＣ　１．１８２６、单增李斯特氏菌ＡＴＣＣ　１５３１３、格氏李斯特氏菌ＡＴＣＣ　７００５４５、西尔李斯特氏菌　ＡＴＣＣ　３５９６７、英诺克李斯特氏菌ＡＴＣＣ　３３０９０、默氏李斯特氏　菌ＡＴＣＣ　２５４０、伊氏李希特氏菌ＡＴＣＣ　１９１１９、威氏李斯特氏　菌ＡＴＣＣ　３５８９７、肺炎克雷伯氏菌ＣＧＭＣＣ　１．１７３６、阴沟肠杆　菌ＣＧＭＣＣ　１．５７、腊样芽孢杆菌ＡＴＣＣ　１１７７８、表皮葡萄球菌　ＡＴＣＣ　１２２２８、甲型副伤寒沙门氏菌ＣＭＣＣ　５０００１、马红球菌　ＡＴＣＣ　６９３６、福氏志贺氏菌ＣＭＣＣ　５１５７１、痢疾志贺氏菌ＣＭ—　ＣＣ　５１２５２、阪崎肠杆菌ＡＴＣＣ　２９５４４、枸橼酸杆菌ＣＭＣＣ　４８０１７、丙型溶血性链球菌ＣＭＣＣ　３２２０６、乙型溶血性链球菌　ＣＭＣＣ　３２２１０、小肠结肠炎耶尔森氏菌ＣＭＣＣ　５２２１２、大肠杆菌　ＡＴＣＣ　２５９２２、肠炎沙门氏菌ＣＭＣＣ　５００４１、金黄色葡萄球菌　性纯系清洁级小鼠，６～８周龄，由北京大学实验动物中心提　供；ＨＲＰ标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ、ＨＲＰ标记的小鼠抗兔ＩｇＧ、　ＲＰＭＩ１６４０培养基及小鼠ｍＡｂ　Ｉｇ亚类检测试剂盒均购自Ｓｉｇ－　ｍａ公司；Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司；Ｓｅｐｈａ—　ｒｏｓｅ　４Ｂ购自Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｅｉａ公司。ＰｏｗｅｒＰａｃ　Ｂａｓｉｃ型垂　直蛋白电泳槽为Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司产品，高速冷冻离心机为Ｂａｃｋ—　ｍａ．ｎ公司产品，ＧＭ２００搅拌捣磨仪为Ｒｅｔｓｅｈ公司产品，３Ｋ一１５　冷冻离心机为Ｓｉｇｍａ公司产品。　１．２方法　１．２．１　菌体培养及鞭毛蛋白的提取Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ　１７８０２菌株接种于Ｔ１Ｎ１培养基，３６￣Ｃ活化２４　ｈ；挑取　单菌落接种于ＴＳＡ（２０　ｇ／Ｌ　ＮａＣ１）培养基生长１８～２４　ｈ；用无　菌棉签将生长良好的菌落均匀涂布在ＴＳＡ（２０　ｇ／Ｌ　ＮａＣ１）培养　基上，３６＂（２培养（１８±２）ｈ。次日用无菌棉签刮下菌体悬浮于　预冷的０．１５　ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１溶液中，冰浴１５～３０　ｍｉｎ，１　０００　ｒ／　ｍｉｎ匀浆４５　Ｓ，立即置于冰上１０　ｒａｉｎ。匀浆液４￣Ｃ条件下　１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ；取上清液４￣Ｃ条件下１６　０００　ｒ／ｍｉｎ　离心２　ｈ，弃上清；沉淀重悬于１ＥＴ（１０　ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，１０　Ｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ．１００）缓冲液中。离心过程重　复３次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少　量Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（０．１　ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ，０．１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，ｐＨ７．８）缓　冲液中，４℃保存备用。　１．２．２　ＳＤＳ．ＰＡＧＥ及透射电镜负染色鉴定提取的鞭毛蛋白　按文献［５］描述的方法进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ。５０　ｇ／Ｌ积层胶，１００　Ｌ分离胶，１２０　Ｖ电压，电泳至胶底部。凝胶用考马斯亮蓝　法染色，脱色后扫描结果。菌体及鞭毛蛋白透射电镜负染色　鉴定委托中国疾病控制中心进行。　１．２．３杂交瘤细胞株的建立以鞭毛蛋白为抗原，免疫６～　８周龄的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠５只，设２只不作免疫小鼠做阴性对　照。按照常规免疫方法　Ｊ，用等体积的福氏完全佐剂与抗原　充分乳化后进行皮下多点注射，４０　ｇ／小鼠。２周后进行第２　次免疫，改用福氏不完全佐剂，抗原量及注射途径不变。抗　血清效价采用间接ＥＬＩＳＡ，以抗原浓度１　Ｉｘｇ／ｍＬ包被９６孔　板。设未免疫小鼠血清为阴性对照，ＰＢＳ为空白对照。末次　免疫效价达到１：３２　０００以上，取效价较高的免疫鼠脾细胞与　Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞在ＰＥＧ作用下融合，ＨＡＴ筛选杂交瘤细　胞株。　阳性克隆筛选与交叉反应ＥＬＩＳＡ结合进行。用霍乱弧菌　７３８　细胞与分子免疫学杂志（Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏ１）２０１３，２９（７　ｃｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉ—ｆｌａｇｅｌｌａｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　磁珠吸附富集等蛋白检测方法以及开展鞭毛蛋白致　病性等后续提供了良好的抗体资源。　参考文献：　［１］齐小保，熊燕，陈智，等．武汉市６起食物中毒副溶血弧菌　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００８，１５（１０）：　１５４１—１５４６．　［８］Ｌｉｎｄｅｔａ　Ｌ，Ｄｅｂ　Ａ，Ｐａｃｈｅｒ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｌｆａｇｅｌｌｉｎ—ｒＩ１ＬＲ５　ａｘｉｓ：ｔｈｅｒａ—　ｐｅｕｔｉｃ　ｏｐｐｏ￣ｕｎｉｉｔｅｓ［Ｊ］．Ｄｒｕｇ　Ｎｅｗｓ　Ｐｅｒｓｐｅｅｔ，２００２，１５（７）：３９７—　４０９．　分子特征研究［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００８，１８（２）：２３４—　２３５．　［９］陈钢，赖卫华，段霞，等．单增李斯特菌鞭毛蛋白提取方法　的研究［Ｊ］．食品科学，２００９，３０（２３）：２６２—２６５．　敏，等．３０１份海水产品副溶血弧菌定量　［１Ｏ］Ｊａｄｅｊａ　Ｒ，Ｊａｎｅｓ　ＭＥ，Ｓｉｍｏｎｓｏｎ　ＪＧ．Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　６矗ｏ　ｖｕｌｎｉｉｃｆ　ｗｉｔｈ　ａｎｔｉｌｆａｇｅｌｌａｒ　ｍｏｎｏｃｌｏｎ￣ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｊ］．Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔ，２０１０，７３（７）：１２８８—１２９３．　［２］张俊彦，梅玲玲，朱检测分析［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２００７，１７（３）：５０９—５１０．　［３］刘秀梅．食源性疾病监控技术的研究［Ｊ］．中国食品卫生杂志，　２００４，１６（１）：３—９．　ｆ　４］Ｍａｎｔｉ　Ａ，Ｆａｌｃｉｏｎｉ　Ｔ，Ｃａｍｐａｎａ　Ｒ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ￣Ｖ／ｂｒ／ｏ　［１　１］Ｓｅｏ　ＳＭ，Ｃｈｏ　ＩＨ，Ｊｅｏｎ　ＪｖＶ，ｅｔ　ａ１．Ａｎ　ＥＬＩＳＡ－ｏｎ－ａ—ｃｈｉｐ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｌｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｙ　ｌｆｏｗ　ｅｙｔｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．　Ｅｎｖ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｒｅｐ，２０１０，２（１）：１５８—１６５．　Ｖｉｂｒｉｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｄａｙ【Ｊ］．Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｔ，２０１０，７３（８）：１４６６—１４７３．　［５］萨姆布鲁克Ｊ，弗里奇ＥＦ，曼尼阿蒂斯Ｔ（金冬雁，等译）．分子　克隆实验指南［Ｍ］．２版．北京：科学出版社，２０００：８８０—８８７．　［１２］Ｂａｌｌａｍｏｏｌｅ　ＫＫ，Ｐｅｎｄｒｕ　Ｒ．Ｄｅｖｅｑｏｗｄａ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂａｓｅｄ　ｓａｎｄｗｉｃｈ　ＥＬＩＳＡ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｆ　ｏ［６］李琦，朱勇，贾卫，等．抗ＦＩＴＣ单克隆抗体的制备及初　步鉴定［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００３，１９（２）：１８０—１８１．　［７］Ｄａｔｔａ　Ｓ，Ｊａｎｅｓ　ＭＥ，Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　ＪＧ．Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｎｄａ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｖｉｂｎｏ　ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ　ｉｎ　ｓｅａｆｏｏｄ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏ—　ｂｉｏｌ，２０１１，１４５：２４４—２４９．　《细胞与分子免疫学杂志》广告刊登启事　为促进生物制剂品、免疫试剂行业的发展，扩大产品销路，沟通生产、销售单位与用户问的联系，本刊　决定在封２、封３、内页和封底开辟广告栏目。主要刊登国内外免疫制品、免疫试剂、生物制品及生物技术产　品及与生物制品及生物技术产品有关的设备、试剂广告，有意者请联系。　广告经营许可证号：陕工商广字９３０１—０９号。　广告刊登须知　１．广告内容应真实、清楚，遵守《中华人民共和国广告法》及国家有关在专业媒体刊登相关广告的政策　法规。　２．企业应提供刊登广告的广告许可证号，生产许可证及相关证件的复印件。请提前１个月提供所刊广告　的有关文字材料及图片，并提供广告菲林片或电子版，用ＣｏｒｅＤｒａｗ软件制作，保证图片质量，格式为分　成文件。刊登的广告内容要求真实客观，否则造成不良的后果责任自负。　３．刊登广告，应事先与本刊签订广告刊登合同书，一式两份。　４．本刊将根据刊户要求和本刊情况安排广告的刊期和版位。　５．刊户应根据广告刊登合同书要求按时付清广告费。　６．有关价格等事宜请电话或传真联系。　联系人：黄老师　电话和传真：０２９．８４７７４５５０