原⼦⼒显微镜及其在⽣物单分⼦研究中的应⽤刘冰 W22046
中国⼈民解放军防化研究院
摘要原⼦⼒显微镜（AFM）是观察样品表⾯结构的⼀种新⼯具，它具有⽐传统扫描电⼦显微镜
更⾼的分辨率，并且可以在⽣理条件下进⾏实时观察。在⽣物单分⼦的研究中，原⼦⼒显微技术已⼴泛⽤于观察⽣物⼤分⼦的超微结构、⽣理⽣化过程以及⽣物分⼦之间分⼦内作⽤⼒的测量。本⽂就相关⽂献进⾏综述。关键词原⼦⼒显微镜（AFM）单分⼦⼒谱
在⽣物单分⼦研究中，⼈们希望实时地看到具体的真实的变化过程，⽽不仅仅是根据前后的现象和关系来推理，即要得到真实的单个分⼦在⼀定时间内的动态⾏为以及分⼦间和分⼦内相互作⽤⼒的变化情况。⽽这种动态变化正是⼈们研究⽣物⼤分⼦结构与功能关系最重要得基础。这就需要更⾼分辨率的显微镜。适应这种需要，许多⽤于表⾯结构分析的现代仪器相继问世，如透射电⼦显微镜（TEM）、扫描电⼦显微镜（SEM）、场离⼦显微镜（FIM）、俄歇电⼦能谱仪（AES）、光电⼦能谱
（ESCA）等，但是⼤多数技术都⽆法真正地直接观测⽣物分⼦地微观世界。原⼦⼒显微镜及基于原⼦⼒显微技术的单分⼦⼒谱的出现为这⼀问题的初步解决奠定了基础。随着原⼦⼒显微技术的不断提⾼，最近短短的⼏年⾥，AFM⼏乎被应⽤到⽣命科学中的每⼀个领域，并取得了许多其它⽅法未能得到的令⼈⿎舞的成果。1 原⼦⼒显微镜的⼯作原理及特点
简单地说，原⼦⼒显微镜在扫描隧道显微镜（STM）的基础上发展起来的。1982年，第⼀台STM问世。其⼯作原理是：当探针与样品表⾯间距离⼩到纳⽶级时，探针与样品间会产⽣隧道电流。STM就是通过检测隧道电流来反映样品表⾯形貌和结构的。STM要求样品表⾯能够导电，从⽽使得STM只能直接观察导体和半导体的表⾯结构；对⾮导电的物质则要求覆盖⼀层导电薄膜，但导电薄膜的粒度和均匀性均难以保证，且导电薄膜掩盖了物质表⾯的细节。为了克服STM的不⾜，在1986年由BiningQuate和Gerber推出了原⼦⼒显微镜（AFM）。AFM是通过探针与被测样品之间的微弱的相互作⽤⼒（原⼦⼒）来获得物质表⾯形貌的信息。因此，AFM除导电样品外，还能够观测⾮导电样品的表⾯结构，且不需要导电薄膜覆盖，其应⽤领域更为⼴阔。它得到的是对应于样品表⾯总电⼦密度的形貌，可以补充STM对样品观测得到的信息，且分辨率亦可达到原⼦级⽔平，其横向分辨率可达2nm，纵向分辨率可达0.01nm。
综合起来讲，原⼦⼒显微镜的⼯作原理就是将探针装在⼀弹性微悬臂的⼀端，微悬臂的另⼀端固定，当探针在样品表⾯扫描时，探针与样品表⾯原⼦间的排斥⼒会使得微悬臂轻微变形，这样，微悬臂的轻微变形就可以作为探针和样品间排斥⼒的直接量度。⼀束激光经微悬臂的背⾯反射到光电检测器，可以精确测量微悬臂的微⼩变形，这样就实现了通过检测样品与探针之间的原⼦排斥⼒来反映样品表⾯形貌和其他表⾯结构。随着原⼦⼒显微技术的迅速发展它在⽣命科学领域的应⽤⽇趋⼴泛，主要涉及以下⼏⽅⾯：⼀是AFM能在真空⽓体液体等多种环境中使⽤，可以在⽣理条件下以分⼦亚分⼦分辨率得到⽣物分⼦及样品表⾯的三位图象；⼆是能对⽣物⼤分⼦的⽣理⽣化过程进⾏实时动态观察；三是能以⽪克⽜顿（pN）的精确度直接测量⽣物分⼦间及分⼦内的作⽤⼒。
2 在⽣物单分⼦研究中的应⽤2.1⽣物⼤分⼦的超微结构观察
原⼦⼒显微镜是观察物质表⾯细微形貌和表⾯加⼯的强有⼒⼯具，它在⽣物形态学上的应⽤引起了⼈们的⼴泛关注。⽬前已应⽤在DNA、蛋⽩质、磷脂⽣物膜、多糖等⽣物⼤分⼦以及有机化合物在空⽓或溶液中的形态观察研究中。
Yang等使⽤AFM观察到β淀粉样蛋⽩（Aβ）的构象变化，即从⾃由盘绕状态向β⽚层和独⽴晶核聚合状态转变的过程，这种
纤维样的结构是阿尔茨海默病的典型特征。作为化学伴侣（chemical chaperons）的有机渗透剂（osmolytes），如：三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide,TMAO）和⽢油可以使部分变性的蛋⽩质优先⽔合，稳定构象和聚集状态。在纤维形成的必经阶段，即Aβ⾃由盘绕向β⽚层构象变化过程中，TMAO和⽢油迅速增加。同时伴随着从⽆定形、⽆结构的形式向统⼀的球形，并有可能产⽣晶核结构的⽅向迅速转变。Aβ⽔合作⽤中的渗透剂的增加也受到淀粉形成的最后阶段的影响和体内初原纤维向成熟纤维转变的调节。这些发现提⽰⽔合⼒可以⽤来控制纤维组装，⽽且可以对细胞器如内质⽹中的Aβ的聚集和淀粉化途径的体内建模提供帮助。
⽤AFM对⽣物⼤分⼦成像的意义不仅在于能在分⼦⽔平上了解⼤分⼦的形态，更重要的是在成像的基础上，可以⽤AFM对⼤分⼦的其它性质进⾏研究，如抗原－抗体之间的相互作⽤、⽣物膜的亲疏⽔性等。Rief 等⽤AFM研究了不同⼤⼩的⼒对单个葡聚糖分⼦的影响，其中可逆的构象变化已经得到分⼦动⼒学计算的证实。Perisk等⽤AFM对视紫红质⽔溶液进⾏研究，发现使⽤不同的成像⼒，晶体表⾯的结构也不相同。
与电⼦显微镜相⽐，AFM样品容易制备，可以观察到完整的蛋⽩分⼦，并可进⼀步对其相关功能进⾏研究。但是AFM成像时会对⼤分⼦施加⼒，因⽽可能会使样品由于受压或牵拉⽽产⽣变形。电镜样品制备复杂，投射电⼦显微镜⽆法观察到完整的⽣物⼤分⼦，⽽扫描电⼦显微镜分辨率底，⽽且需要进⾏喷镀，以使样品具有导电性。2.2⽣物⼤分⼦的⽣理⽣化过程的观察
能够在⽣理条件下对⽣物标本的结构改变进⾏观察，是原⼦显微技术的特征之⼀。迄今为⽌，AFM以⼴泛⽤于⽣理⽣化反应中蛋⽩质、核酸等⽣物⼤分⼦的形态或功能的动态研究。在此基础上还可进⾏分⼦⽔平的热⼒学和动⼒学的研究。
You等⽤AFM实时观察了sapocin C(Sap C)和平坦的磷脂膜之间相互作⽤的动⼒学过程，添加Sap C 会引起磷脂膜的重构，磷脂膜重构引起的表⾯特性的变化主要是出现了板块样的新特征：⾸先在边缘出现，然后随着时间横向扩展，表明这是膜重构期间脂质蛋⽩质结构已经形成的新阶段。这对于了解Sap C和磷脂膜之间的相互作⽤⼗分重要。
配备了环境⽓愤箱的AFM可以在样品箱内进⾏⽓氛控制、样品调整及样品观察。这样可以对⽣物⼤分⼦在各种不同的⽓氛下的形态结构等进⾏研究。
在这个领域⾥研究较多的主要有：蛋⽩的聚合、纤维组装的过程、胶原的超微结构和组装、蛋⽩质三维晶体增长的研究、⽣物膜的结构和⽣物物理特性的变化、DNA的装配过程以及⽣物⼤分⼦之间的交互作⽤等。2.3⽣物分⼦间和分⼦内作⽤⼒的测量
能在分⼦⽔平对⽣物分⼦表⾯的各种相互作⽤进⾏测量，是原⼦⼒显微镜的⼀个⼗分重要的功能，这对于了解⽣物分⼦的结构和物理特性是很有⽤的。2.3.1分⼦间作⽤⼒的直接测量⽐较典型的研究集中在以下两个⽅⾯：
（1）⼤分⼦与⼩分⼦间的相互作⽤⼒（如⼩分⼦抗原与相应抗体）
单个分⼦⽔平的分⼦间相互作⽤的强度的研究是传统的热⼒学及统计⽅法⽆法实现的，直⾄纳⽶⽪⽜顿尺度检测仪器的出现使得这⼀梦想得以实现。早在1994年Gaub等⼈利⽤基于原⼦⼒显微技术的单分⼦⼒谱⽅法研究了⽣物素配体分⼦和抗⽣物素蛋⽩受体分⼦间的特异性相互作⽤。他们在实验过程中，将⼀层⽣物素分⼦固定于氮化硅针尖上，抗⽣物素蛋⽩分⼦通过特异性识别作⽤结合在⽣物素分⼦上。⽤表⾯修饰有⽣物素配体分⼦的琼脂糖颗粒与结合了抗⽣物素蛋⽩分⼦的针尖接触，当针尖进⼀步逼近琼脂糖颗粒时，抗⽣物素蛋⽩分⼦的另两个结合位点与⽣物素分⼦发⽣配体－受体识别并特异性作⽤⽽结合；当针尖远离琼脂糖颗粒时，这种粘滞⼒使悬臂发⽣偏转，随着悬臂弯曲度增⼤，针尖与颗粒间相互作⽤受到不断拉伸，直⾄这种作⽤断裂。为了能够测量出单个⽣物素－抗⽣物素蛋⽩分⼦对的配体－受体相互作⽤⼒的⼤⼩，他们把⼤部分琼脂糖颗粒上的⽣物素分⼦⽤抗⽣物素蛋⽩分⼦结合上，在进⾏扫描实验，这样在每次扫描过程中抗体－抗原的作⽤对数究有效地减少了。在这种条件下，他们得到多个可以区分的⼒扫描信号。将所有实验得到地多个⼒值进⾏统计分析，他们得到了⽣物素－抗⽣物素蛋⽩的单个受体－配体对的相互作⽤⼒为（160±20）pN 。采⽤类似的⽅法，他们还测得脱硫⽣物素－抗⽣物素蛋⽩的相互作⽤⼒为（125±20）pN，以及亚氨基⽣物素－抗⽣物素蛋⽩的作⽤⼒为（85±15）pN。（2）⽣物⼤分⼦之间的作⽤⼒
主要集中在对蛋⽩与蛋⽩之间的相互作⽤⼒及互补核酸链之间的相互作⽤⼒的研究上。利⽤同样的原理AFM可以直接测量蛋⽩性抗原与其相应抗体之间的结合⼒。Allen等曾测得铁蛋⽩与抗铁蛋⽩抗体间的结合⼒约是50 pN。Hinterdorfer等测量了⼈⾎清蛋⽩与抗⼈⾎清蛋⽩之间的结合⼒，
结果约是250 pN。Schwesinger等⽤AFM测量了荧光素－抗荧光素抗体之间的去结合⼒。此外，⽤竞争性解离分析得到溶液中抗原－抗体复合物的解离速度。结果分析表明，解离速度的负对数与去结合⼒成正⽐。因此，AFM能在单分⼦⽔平上得到配体－受体复合物的相对解离速度。⼜由于解离速度是决定亲和⼒⼤⼩的主要因素，所以，AFM还能⽤来分析单个分⼦间的亲和⼒⼤⼩。
互补核酸链之间的相互作⽤的研究⼀直是⼀个研究的热点，他有利于深化⼈们对⽣命基本过程的认识。在此，我们将该相互作
⽤看作是分⼦间相互作⽤。在两条互补核酸链的两个5′端分别施加⼀个外⼒F从⽽导致以双股螺旋结构存在的DNA分离成两个单链，这种现象称为外⼒诱导的DNA 熔融。相应的⼒F就称为熔融⼒。该熔融⼒的⼤⼩反应了螺旋机构的稳定性。核酸地双链结构在外⼒作⽤下所发⽣的另外⼀种变化模式是外⼒诱导的解拉链作⽤（unzipping）。当在两条互补核酸链的3′和5′端分别施加外⼒的时候，我们就可以得到这种解拉链作⽤⼒的⼤⼩。通过将DNA的两条互补链分别固定到AFM的针尖和基⽚上，⼈们可以直接测量互补链之间的熔融⼒和解拉链作⽤⼒。
基于AFM的单分⼦⼒谱⽅法研究互补DNA链熔融⼒⼤⼩的实验过程⽰意图和典型⼒曲线2.3.2分⼦内作⽤⼒
蛋⽩质的折叠结构和锯齿状⼒曲线研究是AFM在此领域的重要应⽤。蛋⽩质的折叠结构以为⼈们所熟知，⼈们利⽤其它光谱⽅法已经对其结构进⾏过研究，⽽对于这种折叠结构的稳定性以及折叠结构形成的推动⼒的直接研究仍然很少见。蛋⽩质的折叠结构。尤其是分⼦内折叠结构，对于其⽣理功能的实现具有重要作⽤。许多机械蛋⽩都具有⼀个统性，即他们的链内包含有靠分⼦内相互作⽤形成的多个独⽴的结构域。由于蛋⽩质的折叠的能量形貌是未知的，所以蛋⽩质的⼒学性质或折叠机理⽆法从热⼒学或结构分析得到。通过将蛋⽩质的两端分别连接于原⼦⼒显微镜针尖和基底之间，⼈们可以直接“感受”到这种结构域的⼒学稳定性。Rief等⼈最早利⽤基于AFM的单分⼦⼒谱⽅法研究了单个肌联蛋⽩质分⼦所形成的结构域在外⼒作⽤下的展开过程，他们得到了锯齿形的⼒学响应信号。为了进⼀步验证这种锯齿形⼒曲线对应着结构域的展开过程，⽽不是由于多个结构域从基⽚表⾯解吸附引起的，Rief等⼜设计并构建了分别含有4个和8个折叠单元的Ig4和Ig8。通过将这种结构确定的短链蛋⽩质的羧基端修饰成巯基，靠巯基与⾦属之间的键合作⽤将这种短链
蛋⽩质固定到⾦基底上，蛋⽩质的另⼀端通过物理吸附固定到氮化硅的针尖上。考虑到肽链的另外⼀端只是通过物理吸附固定到针尖上的，因⽽作⽤位点并不确定，这样最终连接于针尖和基底之间的桥梁结构所包含的结构域的数⽬应该⼩于或等于整个链中所包含的结构域总数（4个或8个）。他们在实验中分别的到了最多含有4个和8个锯齿峰的⼒曲线，这与以上所讨论的情况是相符合的。这⼀结果进⼀步验证了锯齿峰对应结构域依次展开的过程。
⾸先是链中以⽆规线团形式存在的肽链结构受到拉伸，得到如图所⽰的箭头1和2之间的⼒学响应区域。当这种⽆规结构进⼀步被拉伸后，桥联结构中的结构域会受⼒，当外⼒作⽤超过对该结构有稳定作⽤的链内相互作⽤时，结构域便会迅速打开。由于结构域中包含有89到100个氨基酸的长度，所以结构域在外⼒诱导下展开以后，会引起作⽤在桥联结构上的应⼒突然松弛导致微悬臂突然松驰到未受⼒的状态。反映在⼒曲线上为图中箭头2和3所指区域。展开后的结构域在进⼀步拉伸过程中将扮演⽆规线团的⾓⾊，这就是箭头1和4之间的长度⽐1和2之间的长度更⼤的原因。当减少了⼀个结构域的桥联结构进⼀步被拉伸时，它将导致另外⼀个结构域的打开，于是将会产⽣⼀个如箭头4 所⽰的⼒学响应信号，如此重复下去，直到整个桥联结构中的结构域全部打开为⽌。这样，最终得到的⼒曲线就会形成如图所⽰的锯齿形⼒曲线。由于这些结构域是以串联的形式连接于针尖和基底之间形成桥联结构，它们在拉伸过程中会同样地受⼒，⽽这些结构域中最薄弱地⼀个在外⼒作⽤下将⾸先打开，接着第⼆、第三弱的结构域依次被打开。所以，这些串联的结构域并不是从链地⼀端开始依次展开，⽽是遵循由弱到强地规则。值得指出的是，尽管这些结构域含有相同的氨基酸组成，具有⼏乎完全相同的折叠微结构，由于它们在缓冲溶液中会受到热扰动的影响，使得这些处于动态的结构域中总会有相对⽐较薄弱的，⽽这种相对薄弱的结构会在外⼒作⽤下先打开。此
外，Fernandez研究组的实验结果也表明结构域的⼒学稳定性最终决定了结构域的展开次序，⽽与它们的物理连接顺序⽆关。同其它蛋⽩相⽐较，膜蛋⽩更容易在磷脂双分⼦膜中保持其天然构象，因此膜蛋⽩成为研究蛋⽩质结构域的理想体系。
Oesterhelt等⼈将AFM的⾼清晰成像功能和单分⼦拉伸功能联⽤，研究了⼀种膜蛋⽩分⼦——细菌视紫红质在膜中的固定⼒的⼤⼩，以及不同螺旋结构之间的解折叠过程。这种膜蛋⽩分⼦中不同的螺旋结构在膜中的故着⼒在100～200pN之间。随着膜蛋⽩从膜中牵拉出来，螺旋之间的结构域被打开。因此，⼒谱可能有助于解释解折叠路径的专⼀性。2.4其它应⽤
原⼦⼒显微镜不仅是纳⽶尺度表征的强有⼒的⼯具，⽽且是纳⽶尺度上进⾏单分⼦操纵的⼀种⼿段。在⽤AFM直接操纵⽣物⼤分⼦⽅⾯也进⾏了有效的尝试。李辉等曾⽤原⼦⼒显微镜观测并⽤AFM针尖定点切断在硅表⾯拉直的DNA分⼦。为在纳⽶尺度上控制和操纵Si表⾯的DNA分⼦，构建纳⽶结构提供了⼀些经验。3结语
由于AFM独特的成像⽅式，它在⽣物单分⼦研究⼯作中的应⽤得到迅速的发展。但是由于⼈门对微观领域的认识有限，所以现阶段原⼦⼒显微镜对⽣物样品的观测⼤多集中于⽐较单纯的体系中。这在很⼤程度上制约⼒AFM在整个⽣命科学领域中的应⽤。但原⼦⼒显微镜在⽤于⽣物样品等其它专项研究⾥的巨⼤潜⼒已经显⽰出来。尽管⽬前还有许多问题尚未解决，如⽣物软样品分辨率的提⾼、⽣物标本的固定、功能化探针的制备等。但随着制造技术的的不断完善和提⾼，随着⼈们对它了解的加深，原⼦⼒显微镜必将不断拓宽应⽤领域，显⽰出新的强⼤功能，从⽽在更⼤程度上⽣物单分⼦研究的进展。参考⽂献
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