结肠癌细胞组织因子-活性凝血因子Ⅶ通路活化后的基因表达谱改变

生堡塞墅处叠盘查！！！！生！旦筮！！鲞筮！翅垦！地』垦翌！！竖：』！！！！盟！Ｑ！！：！！！：塑：№：！・９・・大肠外科・结肠癌细胞组织因子／活性凝血因子Ⅶ通路活化后的基因表达谱改变陈贺凯汤坚强汪欣万远廉作者单位：１０００３４北京大学第一医院普外科通信作者：汤坚强，Ｅｍａｉｌ：ｄｏｃ—ｔｊｑ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｔｏｍＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１—９０３０．２０１７．０１．００３【摘要】目的利用人类全转录组基因芯片技术检测人ＳＷ６２０结肠癌细胞组织因子／活性凝血因子Ⅶ（ＴＦ／ＦⅦａ）通路激活后表达谱改变，探讨该通路下游机制。方法提取ＴＦ／ＦⅦａ通路活化组与空白对照组的人结肠癌ＳＷ６２０细胞总ＲＮＡ进行全转录组基因芯片杂交，筛选差异表达基因，实时定量反转录聚合酶链反应（ＲＴ—ｑＰＣＲ）验证结果，进行差异基因及相关通路网络分析；ＲＴ—ｑＰＣＲ检测结肠癌细胞ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＨＣＴｌｌ６的ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）配体双调蛋白（ＡＲＥＧ）、表皮调节素（ＥＲＥＧ）、肝素结合表皮生长因子（ＨＢ—ＥＧＦ）、转化生长因子一仅（ＴＧＦ一０【）、３－细胞素（ＢＴＣ）、表皮生长因子（ＥＧＦ）、上皮细胞有丝分裂蛋白（ＥＰＧＮ）的基因表达改变。结果ＴＦ／ＦⅦａ通路活化组较对照组上／下调≥１．５倍的基因共２６３个，其中上调１５０个，下调１１３个；网络分析提示层粘连蛋白．整合素系统、糖代谢通路网络和恶性肿瘤通路网络与ＴＦ／ＦＷｌＩａ通路活化密切相关；ＳＷ６２０细胞ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后ＥＧＦＲ配体ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＨＢ—ＥＧＦ、ＴＧＦ—ｄ基因表达呈时间依赖的上调趋势，于１２ｈ达峰值，相对表达量分别为０．９２±０．１３比５．５０４－０．９１（Ｐ＝０．０００），１．００±０．１５比２．１７±０．４４（尸＝０．００２），１．１１±０．０８比１．７３±０．３２（Ｐ＝０．００５），０．９４±０．１２比１．４９±０．０９（Ｐ＝０．００２）；ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化６ｈ，ＳＷ４８０细胞的ＡＲＥＧ、ＢＴＣ基因表达显著上调，相对表达量分别为１．００±０．２５比２．１９±０．６０（Ｐ＝０．０３３），１．００±０．２３比４．４１±０．５６（Ｐ＝０．００１），ＥＰＧＮ基因未检测到；ＬｏＶｏ细胞的ＡＲＥＧ、ＢＴＣ显著上调，ＥＧＦ显著下调，分别为１．００±０．１９比１．８７±０．３９（Ｐ＝０．０２５），１．００±０．０１比１．８６±０．０６（Ｐ＝０．０００），１．００４－．０．０８比０．６８４－０．１６（Ｐ＝０．０３５）；ＨＣＴｌｌ６细胞的ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＨＢ—ＥＧＦ、ＴＧＦ一仅、ＥＧＦ均显著上调，分别为１．００±０．０９比１．３８±０．０６（Ｐ＝０．００４），１．００±０．０２比１．１４±０．０３（Ｐ＝０．００３），１．００±０．０３比１．８５±０．１１（Ｐ＝０．０００），１．００４－０．０５比１．２６±０．１０（Ｐ＝０．０１５），１．００±０．２６比１．９１±０．２２（Ｐ＝０．０１０）。结论结肠癌细胞中ＴＦ／ＦＶｈ通路活化后可引起层粘连蛋白一整合素系统、糖代谢通路网络及恶性肿瘤通路网络和ＥＧＦＲ通路相关的基因表达改变，这些基因和通路可能在结直肠癌ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路相关生物效应中发挥关键作用。【关键词】结直肠癌；表达谱；组织因子；表皮生长因子受体基金项目：国家自然科学基金（８１２７２７１０、３０８０１０９２）ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｆｔｅｒａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ／ａｃｔｉｖｅｃｏａｇｕ－ｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＶＩＩｓｉｇｎａｌｌｉｎｇＣｈｅｎＨｅｋａｉ，Ｔａｎｇ∥ａｎｑｉａｎｇ，ＷａｎｇＸｉｎ，ＷａｎＹｕａｎｌｉａｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｎｇ１０００３４，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：％昭Ｊｉａｎｑｉａｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｄｏｃ＿ｔｊｑ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＳＷ６２０ｗｈｅｎｉｔｓｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ／ａｃｔｉｖｅｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＶＩＩ（ＴＦ／ＦＶＵａ）ｐａｔｈｗａｙｉｓａｃｔｉｖａｔｅｄａｎｄｄｉｓｃｏｖｅｒｎｅｗｄｏｗｎ－ＴｏｔａｌＲＮＡｓｏｆｔｗｏｇｒｏｕｐｓｏｆＳＷ６２０ｃｅｌｌｓ（ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｓｔｒｅａｍｅｆｆｅｃｔｏｒｓｏｆＴＦ／ＦＶｌＩａｐａｔｈｗａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１００ｎｍｏＬ／ＬＦＶＩＩａｆｏｒ２４ｈｉｎｔｒｅａｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｎｄｉｄｅｎｔｉｃａｌｖｏｌｕｍｅｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｅ—ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｇｅｎｅｃｈｉｐｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｗｅｒｅｒｅｖｅｒｓｅｓｃｒｅｅｎｅｄａｎｄｐａｒｔｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅｖｅｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｒｅａｌ——ｔｉｍｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ—。ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈｍｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ—ｑＰＣＲ），ｎｅｔｗｏｒｋｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓａｎｄｐａｔｈｗａｙｓｗｅｒｅａｎａｌｙｓｅｄ．Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ｌｉｇａｎｄｓａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ（ＡＲＥＧ），ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ（ＥＲＥＧ），Ｈｅｐａｒｉｎ—ｂｉｎｄｉｎｇＥＧＦ—ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＨＢ—ＥＧＦ），ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ一０【ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ一ⅡＰＣＲｆｏｌｌｏｗｉｎｇａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴＦ／ＦⅦａｐａｔｈｗａｙｏｆＳＷ６２０，ＳＷ４８０，ＬｏＶｏａｎｄＨＣＴｌ１６ｃｅｌｌｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｒｅｗｅｒｅ２６３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｗｉｔｈａｔｅｓｔ／ｃｏｎｔｒｏｌｆｏｌｄｃｈａｎｇｅｏｆ≥１．５（１５０ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ，（ＴＧＦ—ｄ），Ｂ—ｃｅｌｌｕｌｉｎ（ＢＴＣ），ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）ａｎｄｅｐｉｇｅｎ（ＥＰＧＮ）ｗｅｒｅ万方数据・１０・生堡塞验处型苤圭！！！！生！旦笠丝鲞箜！塑些也』垦！Ｐ！！！ｇ：』塑！！翌！Ｑ！！：！尘：丝：璺！：！ｌ１３ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）．Ｎｅｔｗｏｒｋａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｇｅｎｅｓｏｆｌａｍｉｎｉｎ—ｉｎｔｅｇｒｉｎｓｙｓｔｅｍ，ｐａｔｈｗａｙｓｏｆｇｌｙｃｏ—ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｃａｎｃｅｒｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙｓｗｅｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＴＦ／ＦＶＩＩａｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ’ｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｇｅｎｅｅｘ－ｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＲＥＧ，ＥＲＥＧ，ＨＢ—ＥＧＦａｎｄＴＧＦ—ｄｏｆＳＷ６２０ｗｅｒｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎａｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒａｎｄｒｅａｃｈｅｄｐｅａｋｓａｔ１２ｈ，ｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｖｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗｅｒｅＯ．９２±０．１３ｖｓ．５．５０±０．９１（Ｐ＝０．０００），１．００±０．１５ｖｓ．２．１７±０．４４（Ｐ＝０．００２），１．１１４－０．０８ｖｓ．１．７３±０．３２（Ｐ＝０．００５），０．９４±０．１２ｖｓ．１．４９±０．０９（Ｐ＝０．００２）．ＷｈｅｎＴＦ／ＦⅦａｐａｔｈｗａｙｗａｓａｃｔｉ—ｖａｔｅｄｆｏｒ６ｈ，ｉｎＳＷ４８０ｃｅｌｌｓ，ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＲＥＧａｎｄＢＴＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐｒｅｇｎｌａｔｅｄ，ｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅ１．ｏｏ±０．２５ｖｓ．２．１９±０．６０（Ｐ＝０．０３３），１．００４－０．２３ｖｓ．４．４１±０．５６（Ｐ＝０．００１），ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＥＰＧＮｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄ．ｉｎＬｏＶｏｃｅｌｌｓ。ＡＲＥＧａｎｄＢＴＣｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｄＥＧＦｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ：１．００±０．１９ｖｓ．１．８７±０．３９（Ｐ＝０．０２５），１．００±０．０１ｖｓ．１．８６±０．０６（Ｐ＝０．０００），１．００±０．０８ｖｓ．０．６８±０．１６（Ｐ＝０．０３５），ｉｎＨＣＴｌｌ６ｃｅｌｌｓ，ＡＲＥＧ，ＥＲＥＧ．ＨＢ—ＥＧＦ，ＴＧＦ—ａ，ａｎｄＥＧＦｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ：１．００±０．０９ｖｓ．１．３８４－０．０６ｆＰ＝０．００４）．１．００４－０．０２ｖｓ．１．１４４－０．０３（Ｐ＝０．００３），１．００±０．０３ｖｓ．１．８５４－０．１１（Ｐ＝０．０００），１．００±０．０５ｖｓ．１．２６±０．１０（Ｐ＝０．０１５）．１．ＯＯ±０．２６ｖｓ．１．９１±０．２２（Ｐ＝０．０１０）．ＣｏｎｄｕｓｉｏｎＩｎＳＷ６２０ｃｅｌｌｓ．ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴＦ／ＦⅦａｐａｔｈｗａｙｃａｎｉｎｄｕｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｇｅｎｅｓｏｆｌａｍｉｎｉｎ—ｉｎｔｅｇｒｉｎｓｙｓｔｅｍ，ｐａｔｈｗａｙｓｏｆｇｌｙｅｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｃａｎｃｅｒｒｅｌａｔｅｄｐａｔｈｗａｙｓａｎｄＥＧＦＲｐａｔｈｗａｙ，ｔｈｅｓｅｅｆｆｅｃｔｏｒｓａｎｄｐａｔｈｗａｙｓｍａｙｔａｋｅｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｓｉｎ７ｎ１／ＦＶｎａｐａｔｈｗａｙ—ｒｅｌａｔｅｄｂｉｏｅｆｆｅｅｔ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｒｅｃｅｐｔｏｒＣｏｌｏｒｅｅｔａｌｃａｎｃｅｒ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅ；Ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ；ＥｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒＦｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１２７２７１０，３０８０１０９２）组织因子（ＴＦ）生理状态下表达于部分上皮细胞及血管外膜。血管破裂时，循环血液中的活性凝血因子Ⅶ（ＦＶＨａ）与血管外膜上的ＴＦ结合为ＴＦ／ＦＶＩＩａ复合物从而启动外源性凝血。除生理凝血功能外，ＴＦ／ＦＶｌｉａ复合物在恶性肿瘤的进展过程中发挥重要作用。ＴＦ在ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＨＣＴｌｌ６购自美国典型菌种保藏中心（ＡＴＣＣ）；高糖杜尔伯科改良伊格尔培养基（ＤＭＥＭ）、胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ公司）；反转录试剂盒、荧光染料ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ均购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；相关引物由上海生工生物工程公司合成；细胞刺激药物重组活化人凝血因子７（ｒｈＦⅦａ）购自丹麦Ｎｏｖｏｎｏｒｄｉｓｋ公司。众多恶性实体肿瘤中呈现异常高表达…，我们前期研究结果也证实了人结直肠癌组织中ＴＦ的表达与肿瘤浸润深度、肝转移相关拉引。研究结果显示，ＴＦ／ＦＶＩＩａ复合物可引发一系列胞内信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）通路、凋亡及自噬相关通路、蛋白酶激活受体．２（ＰＡＲ－２）通路等，最终促进肿瘤细胞的侵袭、转移ｐ。７１。但ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路在不同的恶性肿瘤中２．表达谱芯片ＲＮＡ样本准备：（１）方案设计：设空白对照组和ＴＦ／ＦⅦａ通路激活（ＦＶＩ［ａ刺激）组，每组各３个生物学重复以便后续生物信息统计分析（对照组Ｃ一１、Ｃ－２、Ｃ．３；实验组Ｔ一１、Ｔ－２、Ｔ一３）。（２）细胞培养及药物刺激：ＳＷ６２０细胞均匀铺于６孔板，以含１０％胎牛血清（ＦＢＳ）的ＤＭＥＭ完全培养基在３７ｏＣ、５％ＣＯ，条件下培养，在细胞生长至６０％融合时进行饥饿处理，弃培养基，可能有不同的下游通路参与其恶性进展；另外我们前期研究结果显示，结肠癌细胞ＴＦ／ＦＶｌＩａ通路活化后可旁路激活磷酸化表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）Ｔｙｒ８４５位点，结合文献中报道的异常活化的表皮生长因子受体（ＥＧＦＲ）可上调恶性胶质瘤细胞ＴＦ、ＦⅦ表达伸ｏ，我们推无菌磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗３遍，每孔加新鲜不含ＦＢＳｈ后弃培养基，换新鲜ＤＭＥＭ培养基，ＴＦ／ＦＶｌＩａ通路激活组加１００ｎｍｏｌ／Ｌ的ＦＷａ，对照组加等培养基２ｍｌ，１２体积ＰＢＳ，继续培养２４ｈ。测结直肠癌细胞中可能存在ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路与ＥＧＦＲ通路间的交叉对话机制。我们通过人全转录组基因芯片及生物信息分析技术，观察结肠癌中ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后引发的下游信号通路变化，并验证ＴＦ／ＦＶＩＩａ．ＥＧＦＲ通路相关性的推测，同时检测结直肠癌中与ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化相关的新的关键分子和信号通路。材料与方法１。材料：人类全转录组基因芯片采用美国Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ公司的Ｈｕｍａｎ２．０，包含探针４８７２ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＡｒｒａｙ３．ＲＮＡ提取与质检：ＦⅦａ刺激细胞２４ｈ后弃去ｍｌ，充分振荡混匀，将细胞裂解液转移至Ｅｐ管，提取总ＲＮＡ，各样本上样于１％琼脂糖凝胶孔中，１２０Ｖ电压下电泳５ｍｉｎ，培养基，ＰＢＳ洗３次，每孔加Ｔｒｉｚｏｌ１紫外灯下观察拍照；分光光度计检测ＲＮＡ样品纯度（Ａ２６０／Ａ：。。）和浓度，记录。４．芯片杂交：由总ＲＮＡ相继合成互补ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）第１链、ｃＤＮＡ第２链、互补ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）并纯化，合成第２链单链ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ），纯化后片段化处理，标记后立即进行芯片杂交。５．采用Ｇｅｎｅ．ＣｌｏｕｄｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ２．０（ＨＴＡ１９１个，共覆盖４４６９９个人类编码基因），后续生物信息分析使用上海其明信息技术公司提供的线上分析系统；人结肠癌细胞株ＳＷ６２０、万方数据（ＧＣＢＩ）线上分析系统（上海其明信息技术有限公司）进行差异ｍＲＮＡ筛选（筛选条件：统计学差异Ｐ值＜主堡塞坠处整盘查垫！！生！旦筮丝鲞筮！塑坠也』垦翌！！！ｇ：』塑！！翌！！！！：∑丝：丝：盟！：１０．０５，阳性误判率Ｑ值＜０．０５，实验组上／下调倍数≥２．芯片结果分析：ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化组较之对照１．５）、差异基因网络分析和差异基因相关通路（ｐａｔｈｗａｙ）网络分析。６．芯片结果差异基因验证：提取对照组、ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化组细胞总ＲＮＡ，实时定量反转录聚合酶链反应（ＲＴ・ｑＰＣＲ）检测芯片上调基因表皮膜蛋白１（ＥＭＰｌ）、双特异性蛋白磷酸酶５（ＤＵＳＰ５）、生长分化因子１５（ＧＤＦｌ５）、白细胞介素２３ｃ１亚基（ＩＬ－２３Ａ）、ＳＬＣ７Ａ１１、ＣＣ型趋化因子２０（ＣＣＬ－２０）、白细胞介素－８（ＩＬ一８），下调基因钙蛋白酶６（ＣＡＰＮ６）、碳酸酐酶９（ＣＡ９）、分泌模块化钙结合蛋白２（ＳＭＯＣ２）、ＫＩＦ２０Ａ、组，表达上调１．５倍以上的基因共１５０个，包括３个关注基因（ＡＲＥＧ上调３．１５倍，ＥＲＥＧ上调１．８２倍，ＨＢ—ＥＧＦ上调１．５０倍），下调１．５倍以上的共１１３个，差异表达ｍＲＮＡ聚类分析及火山图见图２，部分差异表达ｍＲＮＡ列于表１；差异基因网络、差异基因相关ｐａｔｈｗａｙ网络（图３）分析结果显示，层粘连蛋白一整合素系统相关基因表达改变与ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化相关度最高，ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后该系统相关基因均表达上调；ｐａｔｈｗａｙ网络图显示ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后，主要有糖代谢通路网络和恶性肿瘤通路网络两大网络相关基因表达改变，网络所包含通路见图３。ＰＬＯＤ２、细胞分裂周期相关蛋白７（ＣＤＣＡ７）的基因表达改变（验证的差异基因为经ＰｕｂＭｅｄ文献检索挑选的与肿瘤有相关性的基因）。实验独立重复３次。７．验证关于ＥＧＦＲ通路与ＴＦ／ＦＶｌｌａ通路可能存在相关性的推测，激活ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路后检测ＥＧＦＲ７个配体的基因表达，并在结肠癌细胞ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＨＣＴｌｌ６中重复验证：ＳＷ６２０细胞设对照组（０ｈ）、ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化组，饥饿处理１２ｈ后，以１００ｎｍｏＶＬ３一。。＇爨要是一。，、’＿’－‘ｏ■－二’，’■●●■■－．蠼童一一．‘≮；昌昌｝＝≤龋ｉ一一一一４５６Ｊ■■■■■■■■●—一警鐾套嘉罴囊——葛冒一…——黑言＝ｊ誉善———１量甍Ｉ一…ｊ—‘÷，：＝＝＝’—■广。｝一一－一；耋耋的ＦＶｌＩａ刺激ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化组各组细胞，对照组加等体积无菌ＰＢＳ，分别于０、２、６、１２ｈ提取总ＲＮＡ，ＲＴ—ｑＰＣＲ检测ＥＧＦＲ７个配体——双调蛋白（ＡＲＥＧ）、Ｂ鼍！曼鬯Ⅻ“叫～一“＿Ｉ＿—●■■皇ｒ一奢寞曼，鼋曼苎苎虽一一一．—上每鱼｝一一４表皮调节素（ＥＲＥＧ）、肝素结合表皮生长因子（ＨＢ—ＥＧＦ）、转化生长因子．仅（ＴＧＦ．ｄ）、３－细胞素（ＢＴＣ）、表皮生长因子（ＥＧＦ）、上皮细胞有丝分裂蛋白＂３豁（ＥＰＧＮ）基因表达改变；设置空白对照组和ＦＶＩＩａ刺激组（１００ｎｍｏＬ／Ｌ刺激时间６ｈ），在结肠癌细胞株ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＨＣＴｌｌ６中检、狈４７个配体基因表达改变。实验均独立重复３次。８．统计学方法：芯片结果分析采用ＧＣＢＩ生物信息线上分析系统（差异表达基因采用ＳＡＭ法筛检差异，－昌８，蛇Ｏ％倍数不小于１．５倍且Ｐ＜０．０５，阳性误判率Ｑ＜０．０５的基因）；基因表达结果以均数４－标准差（面±ｓ）表示，应用ＳＰＳＳ２０．０统计学软件，采用单因素方差分析及注：Ａ：差异基因聚类图，红色代表高表达信号，绿色代表低表达信号；１～３：ＴＦ／ＦⅦａ通路活化组；４—６：空白对照组；ＦＶＩＩａ：活性凝血因子Ｗａ；Ｂ：差异基因火山图，红色点为筛选的差异表达基因图２筛选差异基因的聚类图、火山图独立样本ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。结果３．ＲＴ．ｑＰＣＲ验证芯片结果：经ＲＴ—ｑＰＣＲ验证，芯片１．用于芯片检测的ＲＮＡ样本质检合格（图１）。二３４１结果上调基因ＥＭＰｌ、ＤＵＳＰ５、ＧＤＦｌ５、ＩＬ－２３Ａ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＣＣＬ．２０、ＩＬ．８在ＦＶＩＩａ刺激细胞２４ｈ后均较对照组显著上调，对照组与实验组基因相对表达量分别为０．９７４－５６８０．１９比８．３１４－０．２１（Ｐ＝０．０００）、１．１０４－０．２６比１２．３３±１．０２（Ｐ＝０．０００）、０．９３±０．２１比４．１５４－０．７９（Ｐ＝注：ｌ，３～４：空白对照组，５～７：ＦⅦａ刺激组；２，８：Ｍａｒｋｅｒ；ＦⅦａ活性凝血因子Ⅶ图１０．００２）、１．１０４－０．１８比５．８９±０．５０（Ｐ＝０．０００）、０．９３±０．２８比３．０９±０．５０（Ｐ＝０．００１）、１．１３±０．３１６个样本ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果比５．９３４－１．０２（Ｐ＝０．００３）、１．１３－４－０．２８比３．４８４－万方数据・１２・生堡塞堕处型盘查！Ｑ！！生！旦篁丝鲞筮！塑堡生！』垦！Ｐ！！疆：』！！！！型！！！！：！！！：翌：璺！：！表１部分差异表达ｍＲＮＡＬ趔Ａ３ＳＯＲ才弘ｂ＼十，ＡＬＤｏｃ，夕哪㈣＼警６●一心／。●，戈√Ｂ｝｝！一ｍ．＼艇注：差异表达ｍＲＮＡ中，ＴＦ／ＦＶＨａ通路活化组表达上调１．５倍以上的基因共１５０个，下调１．５倍以上的共１１３个；其中关注基因（ＥＧＦＲ配体）ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＨＢ—ＥＧＦ分别上调３．１５、１．８２、１．５０倍（表中８标注）；ＥＭＰｌ：表皮膜蛋白１；ＡＲＥＧ：双调蛋白；ＧＤＦｌ５：生长分化因子１５；ＩＬ－２３Ａ：白细胞介素－２３ｃｔ亚基；ＩＬ一８：白细胞介素－８；ＬＡＭＡ３：层粘连蛋白ｑ３亚基；ＩＴＧＡ２：整合素以亚基；ＭＡＰｌＢ：微管相关蛋白１Ｂ；ＣＣＬ２０：Ｃ—Ｃ域趋化因子２０；ＥＲＮｌ：内质网核信蛋白号ｌ；ＥＲＥＧ：表皮调节素；ＨＢ．ＥＧＦ：肝素结合表皮生长因子；ＲＯＲｌ：受体酪氨酸激酶样孤立受体１；ＰＬＣＨｌ：磷脂酶＂１＂１１；ＣＤＣＡ７：细胞分裂周期相关蛋白７；ＳＭＯＣ２：ＳＰＡＲＣ相关钙结合蛋白２；ＥＧＬＮ３：ｅｇｌ－９家族缺氧诱导因子３；ＣＡ９：碳酸酐酶９；ＣＡＰＮ６：钙蛋白酶６注：Ａ：差异基因网络图红色为上调基因，蓝色为下调基因，两个基因的共表达关系用连线表示，箭头表示上下游，点的大小代表与之有共表达关系的基因数量多少。ＦＬＮＢ：细丝蛋白Ｂ；ＬＡＭＣ２：层粘连蛋白啦亚基；ＬＡＭＡ３：层粘连蛋白ｄ３亚基；◆ｐ≯“６越。。５３ｓｉｇｍａａ、ＩＴＧＡ２：整合索以亚基；ＩＴＧＢ８：整合素Ｂ８亚基；ＨＭＧＣＳｌ：３一羟基．３．甲基戊二酰・辅酶Ａ合成酶１；ＩＴＧＡ６：整合素ｄ６亚基；ＯＸＣＴ，：３－酮酸辅酶Ａ转移酶ｌ；ＳＦＮ：人分层蛋白；ＰＦＫＭ：肌型６一磷酸果糖激酶；ＡＬＤＯＣ：果糖二磷酸醛缩酶Ｃ；ＣＣＮＢ２：细胞周期蛋白Ｂ２；ＥＴＳＩ：ＥＴＳ原癌基因ｌ；ＩＬ－８：白细胞介素－８；ＤＧＫＨ：甘油二酯激酶－ｑ；ｕＰｃ：脂肪酶Ｃ；ＳＥＲＰＩＮＥｌ：丝氨酸蛋白酶抑制剂家族Ｅ成员１；ＰＬＡＵ：尿激酶；ＰＬＡＵＲ：尿激酶受体；ＳＯＲＤ：山梨醇脱氢酶；ＨＫ２：己糖激酶２；Ｂ：差异基因相关ｐａｔｈｗａｙ网络图，每个点代表１个ｐａｔｈｗａｙ，黄色代表该ｐａｔｈｗａｙ同时存在上调基因、下调基因，其他标识与Ａ相同。Ｆａｔｔｙｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：脂酸降解；Ｐａｔｈｗａｙｓｉｎａｃｄ０．４３（Ｐ＝０．００１），与芯片结果趋势一致；下调基因中ＣＡＰＮ６、ＳＭＯＣ２、ＣＤＣＡ７的ＦＶＩＩａ刺激组表达量显著低于对照组，相对表达量分别为１．００±０．２２比０．６０±０．１１（Ｐ＝０．０４７）、１．００±０．２１比０．６１±０．１３（Ｐ＝ｅａｎｃｅｒ：恶性肿瘤相关通路；ｂｏｄｉｅｓ：酮体的生成和降解；ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｋｅｔｏｎｅＦｏｃａｌ０．０４９）、１．００±０．０８比０．６５±０．１１（Ｐ＝０．０１２），ＣＡ９、ＫＩＦ２０Ａ、ＰＬＯＤ２两组表达量差异无统计学意义（Ｐ值ａｄｈｅｓｉｏｎ：粘着斑；Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：甘油脂类代谢；ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：细胞因子一细胞因子受体ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：自然杀伤细胞ｓｉｇ－Ｃｙｔｏｋｉｎｅ—ｅｙｔｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ分别为０．５３９、０．４２７、０．１３４）。验证结果整体与芯片结果趋势大致一致。相互作用；Ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄｓｉｇｎａｌｉｎｇ相关细胞毒性；ｐ５３ｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ：ｐ５３信号通路；ＥｒｂＢｐａｔｈｗａｙ：ＥｒｂＢ信号通路；ＥＣＭ—ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ：胞外４．ＥＧＦＲ通路与ＴＦ／ＦＷｌｌａ通路相关性验证：（１）以１００基质一受体相互作用；Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ／Ｇｌｕｃｏｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ：糖酵解／生成；ＭＡＰＫｎｍｏｌ／Ｌ的ＦＶＩＩａ刺激ＳＷ６２０细胞激活ＴＦ／ＦＶＩＩａ通ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ：ＭＡＰＫ信号通路；Ｊａｋ—ＳＴＡＴｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄ路后，ＥＧＦＲ配体ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＨＢ—ＥＧＦ、ＴＧＦ—Ｏｔ基因表达呈时间依赖的上调趋势，于１２ｈ达到峰值，４个基因ｐａｔｈｗａｙ：Ｊａｋ－ＳＴＡＴ信号通路；Ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ：细胞周期；Ｆｒｕｃｔｏｓｅｍａｎｎｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：果糖与甘露糖代谢；Ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：对照组与ＦＶＩＩａ刺激组相对表达量分别为０．９２±０．１３比５．５０±０．９１（Ｐ＝０．０００），１．００±０．１５比２．１７±０．４４（Ｐ＝０．００２），１．１１±０．０８比１．７３±０．３２（Ｐ＝０．００５），０．９４±０．１２比１．４９±０．０９（Ｐ＝０．００２）；ＢＴＣ、ＥＧＦ、半乳糖代谢图３差异基因表达网络图和相关ｐａｔｈｗａｙ网络图０．５９５、０．２８７、０．６４９）。（２）在结肠癌细胞株ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＨＣＴｌｌ６中检测ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后ＥＧＦＲ配体基因表达改变：３个细胞株中均有部分ＥＧＦＲ配体ＥＰＧＮ基因表达差异无统计学意义（Ｐ值分别为万方数据史堡塞堕处型苤查垫！！生！旦箍丝鲞箜！塑竖地！』垦！Ｐ！！垡：』堂！！翌！！！！：！！！：丝：盟！：！・１３・基因在ＦＶＩＩａ刺激６ｈ后表达显著上调，ＳＷ４８０中ＦＶｌＩａ刺激组的ＡＲＥＧ、ＢＴＣ表达量显著高于对照组，分别为１．００±０．２５比２．１９±０．６０（Ｐ＝０．０３３）．１．００±０．２３比４．４１±０．５６（Ｐ＝０．００１），ＥＰＧＮ基因未检测到；ＬｏＶｏ细胞中ＦＶＩＩａ刺激组的ＡＲＥＧ、ＢＴＣ显著上调，ＥＧＦ表达则显著下调，分别为１．００±０．１９比１．８７±０．３９（Ｐ＝０．０２５），１．００±０．０１比１．８６±０．０６（Ｐ＝０．０００），１．００±０．０８比０．６８±０．１６（Ｐ＝０．０３５）；ＨＣＴｌｌ６细胞中ＦＶｌＩａ刺激组的ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＨＢ—ＥＧＦ、ＴＧＦ一０Ｉ、ＥＧＦ均显著上调，表达量为１．００±０．０９比１．３８±０．０６（ＪＰ＝０．００４），１．００±０．０２比１．１４±０．０３（Ｐ＝０．００３），１．００±０．０３比１．８５－４－０．１１（Ｐ＝０．０００），１．００±０．０５比１．２６±０．１０（Ｐ＝０．０１５），１．００±０．２６比１．９１±０．２２（Ｐ＝０．０１０）。讨论本研究通过活化结肠癌ＳＷ６２０细胞ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路后检测表达谱改变，经ＲＴ．ｑＰＣＲ验证与芯片结果大致一致，少数验证结果不一致者分析可能限于ＲＴ—ｑＰＣＲ的检测方法或芯片实验样本量较小导致少数结果不够稳定所致；利用生物信息学技术分析了ＴＦ／ＦＶｌＩａ通路活化后细胞基因表达网络及ｐａｔｈｗａｙ网络变化。芯片结果支持实验前对ＴＦ／ＦⅦａ—ＥＧＦＲ双通路相关性的推测，并在多种结肠癌细胞株中得到进一步验证。本研究结果验证了既往关于恶性肿瘤细胞中ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路的文献报道，如层粘连蛋白．整合素系统、尿激酶及其受体参与了ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后的下游机制’７’９Ｊ，多个经典的肿瘤相关通路也已被证实参与癌细胞ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路诱导的肿瘤恶性进展过程Ｈｍｌ３Ｊ，提示结直肠癌中也存在相似的作用机制；此外根据ｐａｔｈｗａｙ网络分析提示，ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化后可引起糖代谢通路及ＥｒｂＢ通路的改变。ｐａｔｈｗａｙ网络分析中关于ＥｒｂＢ通路的改变，验证了我们实验前提出的ＥＧＦＲ通路与ＴＦ／ＦＶＩＩａ通路活化存在相关性的推测。既往关于恶性肿瘤中该两条通路的相关性研究旧，１２ｏ较少，且缺乏深入研究，在结直肠癌中则尚无相关报道。目前临床上晚期结直肠癌患者可受益于抗ＥＧＦＲ单抗靶向治疗仅为部分ＫＲＡＳ（ＥＧＦＲ下游效应蛋白）基因野生型患者，且其客观反应率仅为４０％～６０％ｏｔ４］，这一方面表明ＥＧＦＲ通路参与了结直肠癌的恶性进展，另一方面提示仍存在ＥＧＦＲ相关或以外的其他机制促进癌细胞侵袭、转移，单纯针对ＥＧＦＲ靶向治疗疗效有限。参考文献［１］ＣａｌｌａｎｄｅｒＮＳ，ＶａｒｋｉＮ，ＲａｏＬＶ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ万方数据ｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｉｎｓｏｌｉｄｔｕｍｏｒｓＩＪＩ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９２，７０（５）：１１９４—１２０１．ＤＯＩ：１０．１００２／１０９７—０１４２（１９９２０９０１）７０：５＜１１９４：：ＡＩＤ—ＣＮＣＲ２８２０７００５２８＞３．０．Ｃ０：２一Ｅ．［２］吴楠，万远廉，王振军，等．组织因子表达与直肠癌肝转移的关系及其调控［ｊ］．中华胃肠外科杂志，２００２，５（１）：５６－６０．ＷｕＮ，ＷａｎＹＬ，ＷａｎｇＺＪ，ｅｔａ１．ＴｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｗｉｔｈｌｉｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏＩＪ］．ＣｈｉｎＪＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔＳｕｒｇ，２００２，５（１）：５６－６０．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｉ－ｉｓｓｎ，１６７１－０２７４．２００２．０１．０１５．［３］戎龙，万远廉，刘玉村，等，组织因子对大肠癌细胞肝转移能力的作用［Ｊ］．中华实验外科杂志，２００６，２３（５）：５９７－５９８．ＲｏｎｇＬ．ＷａｎＹＬ，ＬｉｕＹＣ，ｅｔａ１．ＴｈｅｒｏｌｅｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓｏｆｃｏｌｏｒｅｅｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏＩＪ１．ＣｈｉｎＪＥｘｐｓｕｒｇ，２００６．２３（５）：５９７－５９８．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｊ．ｉｓｓｎ：１００１－９０３０．２００６．０５．０２９．［４］ＪｉａＺＣ，ｗａｎＹＬ，ＴａｎｇＪＱ，ｅｔａ１．Ｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ／ａｃｔｉｖａｔｅｄｆａｃｔｏｒⅦａｉｎ・ｄｕｃｅｓｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－７ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃ．ＦｏｓｖｉａＥＲＫｌ／２ａｎｄＴａ８ＭＡＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ［Ｊ］．ＩｎｔＪＣｏｌｏｒｅｃｔａｌＤｉｓ，２０１２，２７（４）：４３７４４５．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００３８４－０１ｌ一１３５１．０．［５］万远廉，戎龙，刘玉村，等．组织因子对大肠癌侵袭能力的影响及其与基质金属蛋白酶－９的关系［Ｊ］．中华实验外科杂志，２００４，２１（９）：１０８７—１０８８．ＷａｎＹＬ，ＲｏｎｇＬ，ＬｉｕＹＣ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｒｏｌｅｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｉｎｖａ—ｓｉｏｎｏｆｅｏｌｏｒｅｅｔａｌｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏ—ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９［Ｊ］．ＣｈｉｎＪＥｘｐＳｕｒｇ，２００４，２１（９）：１０８７—１０８８．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｊ．ｉｓｓｎ：１００１－９０３０．２００４．０９．０２６．『６１ＳｏｒｅｎｓｅｎＢＢ，ＲａｏＬＶ，ＴｏｍｅｈａｖｅＤ，ｅｔａｌＡｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏ．ａｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒⅦａｔＪ］．Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０２（５）：１７０８—１７１５．ＤＯＩ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２００３－０１－０１５７．『７］ＴａｎｉｇｕｃｈｉＴ，ＫａｋｋａｒＡＫ，ＴｕｄｄｅｎｈａｍＥＧ，ｅｔａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｕｒｏｋｉｎａｓｅｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｄｕｃｅｄｔｈｍｕｇｈｔｈｅｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ－ｆａｃｔｏｒⅦａｐａｔｈｗａｙｉｎｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ，１９９８，５８（１９）：４４６１－４４６７．［８］ＧａｍｉｅｒＤ，ＭｉｌｓｏｍＣ，ＭａｇｎｕｓＮ，ｅｔａ１．Ｒｏｌｅｏｆｔｈｅｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｐａｔｈ—ｗａｙｉｎｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｕｍｏｒｉｎｉｔｉａｔｉｎｇｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ，２０１０，１２５Ｓｕｐｐｌ２：￥４４－￥５０．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｓ００４９－３８４８（１０）７００１２．８，『９］ＤｏｒｆｌｅｕｔｎｅｒＡ。ＨｉｎｔｅｒｍａｎｎＥ，ＴａｒｕｉＴ，ｅｔａ１．Ｃｒｏｓｓ—ｔａｌｋｏｆｉｎｔｅ！加ｎａｌ—ｐｈａ３ｂｅｔａｌａｎｄｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｉｎｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎＪ１．ＭｏｌＢｉｏｌＣｅｌｌ，２００４．１５（１０）：４４１６－４４２５．ＤＯＩ：１０．１０９ｌ／ｍｂｃ．Ｅ０３－０９－０６４０．［１０］ＰｏｕｌｓｅｎＬＫ，ＪａｃｏｂｓｅｎＮ，ＳｏｒｅｎｓｅｎＢＢ，ｅｔａ１．Ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｅｔｉｏｎｖｉａｔｈｅｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｐａｔｈｗａｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙｂｉｎｄｉｎｇｏｆｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒⅦａｔｏｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ『ＪＩ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９８，２７３（１１）：６２２８－６２３２．［１１］ＣａｍｅｒｅｒＥ，ＲｏｔｔｉｎｇｅｎＪＡ，ＧｊｅｒｎｅｓＥ，ｅｔａ１．ＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓＶａａａｎｄＸａｉｎｄｕｃｅｃｅｌｌｓｉｇｃｍｌｉｎｇｌｅａｄｉｎｇｔｏｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｇｒ—ｌｇｅｎｅ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，１９９９，２７４（４５）：３２２２５．３２２３３．ＤＯＩ：１０．１０７４／ｉｂｃ．２７４．４５．３２２２５．［１２］ＷｉｉｇｅｒＭＴ，ＰｒｙｄｚＨ．Ｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）ａｎｄｐｒｏｌｉｎｅｒｉｃｈｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ２（ＰＹＫ２）ａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｉｓｓｕｅｆａｃ—ｔｏｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔｆａｃｔｏｒＶＩＩａｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｉｎＨａＣａＴｃｅｉｌｓＪ１．ＴｈｒｏｍｂＨａｅ—ｍｏｓｔ．２００４．９２（１）：１３－２２，ＤＯＩ：１０．１２６７／ＴＨＲ００４０７００１３．［１３］ｗｕＹ，ＺｈａｎｇＸ，ＺｈｏｕＨ，ｅｔａ１．ＦａｃｔｏｒＶＩＩａｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ一３，ＭＭＰ－９，ａｎｄＣＤ４４ｉｎＳＷ６２０ｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｖｏｌｖｉｎｇＰＡＲ２／ＭＡＰＫｓ／ＮＦ—ｋａｐｐａＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅｓｔ，２０１３，３１（１）：７—１６．ＤＯＩ：１０．３１０９／０７３５７９０７．２０１２．７４３５５６．［１４］Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｍｉｃａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｐｒａｃｔｉｃｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＧＡＰＰ）ｗｏｒｋｉｎｇｇｒｏｕｐ．ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｔｈｅＥＧＡＰＰｗｏｒｋｉｎｇｇｒｏｕｐ：ｃａｎｔｅｓｔｉｎｇｏｆｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｆｏｒｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＥＧＦＲｐａｔｈｗａｙｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｅｌ－ｆｅｅｔｏｒｇｅｎｅｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｅｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｉｍｐｒｏｖｅｈｅａｌｔｈｏｕｔｃｏｍｅｓｂｙｇｕｉｄｉｎｇｄｅｃｉｓｉｏｎｓｒｅｇａｒｄｉｎｇａｎｔｉ—ＥＧＦＲｔｈｅｒａｐｙ？Ｊ１．ＧｅｎｅｔＭｅｄ，２０１３，１５（７）：５１７．５２７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｇｌｍ．２０１２．１８４．（收稿日期：２０１６－０５－１７）