α-咔啉类化合物,其制备方法以及用途[发明专利]

2021-03-06 来源：小奈知识网

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105820165 A (43)申请公布日 2016.08.03

(21)申请号 201510005697.6(22)申请日 2015.01.05

(71)申请人中国科学院上海药物研究所

地址201203 上海市浦东新区张江祖冲之路

555号(72)发明人杨春皓缪泽鸿张小飞衣君玫

贺茜宦霞娟宋姗姗王迎庆陈奕丁健(74)专利代理机构上海一平知识产权代理有限

公司 31266

代理人崔佳佳陆凤(51)Int.Cl.

C07D 471/04(2006.01)A61K 31/437(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/02(2006.01)

权利要求书4页说明书47页附图2页

(54)发明名称

α-咔啉类化合物，其制备方法以及用途(57)摘要

本发明提供了一类α-咔啉类化合物，其制备方法以及用途，具体地，本发明提供了一类具有如下通式Ⅰ所示结构的化合物，其中，各基团的定义如说明书中所述。所述的式I化合物具有拓扑异构酶Ⅱ和微管蛋白双重抑制效果，可以抑制癌

细胞的增殖。。

C N 1 0 5 8 2 0 1 6 5 A CN 105820165 A

权利要求书

1/4页

1.一类具有如下通式Ⅰ所示结构的化合物：

其中，

R1、R2、R3、R4各自独立地选自下组：氢、卤素、硝基、氨基、羟基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C3-C6的环烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链亚烷基-胺基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基，以及取代或未取代的含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；

R5选自下组：氢、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C3-C6的环烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链亚烷基-羟基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基，以及取代或未取代的含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；

R6选自下组：氢、卤素、羟基、氨基、甲氨基、二甲氨基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基-氧基；

R7选自下组：氢、卤素、羟基、氨基、甲基、甲氧基、甲氨基、二甲氨基，-OAc、甲氧羰基，乙酰氨基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基；

R8选自下组：氢、卤素、羟基、氨基、甲基、甲氧基、甲氨基、二甲氨基、甲氧羰基、乙酰氨基、甲砜基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基；

X为链接基团，选自下组：亚甲基、氧、硫、羰基、亚砜基、砜基、

其中，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷基-胺基、羟基、甲基胺基、氨基、C1-C8烷基-氧基。

2.如权利要求1所述的式I化合物，其特征在于，R5选自下组：氢、羟乙基、N,N-二甲基氨基乙基；R6选自下组：氢、羟基、-NH-CH3、-NH2、-N(CH3)2、-O(CH2)2OH、-O(CH2)2N(CH3)2；R7选自下组：氢、氟、羟基、甲基、甲氧基、乙酰氨基、-OAc；R8选自下组：氢、氟、氯、溴、甲基、甲氧基、乙酰氨基、二甲氨基、甲砜基；

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权利要求书

羰基、亚砜基、砜基、

2/4页

X选自下组：氧、硫、

3.如权利要求1所述的式I化合物，其特征在于，

R1为氢、氟；R2为氢、氟、氯、甲氧基、二甲胺基、吗啉基；R3为氢、氟、氯、甲氧基；R4为氢、氟、甲氧基；R5为氢、羟乙基、N,N-二甲基氨基乙基；R6为氢、羟基、氨基、甲胺基、二甲胺基、-O(CH2)2OH、-O(CH2)2N(CH3)2；R7为氢、氟、羟基、甲氧基、-OAc；R8为氢、氟、氯、溴、甲氧基、乙酰氨基、二甲氨基、甲砜基；X为链接的硫、甲氨基、羰基、亚砜基、砜基、

4.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤(b)和任选的(c)、(c1)和/或(c2)：

(b)在有机溶剂中，在还原剂存在下，用式3化合物进行关环反应，得到式Ia化合物；

(c)在有机溶剂中，在碱存在下，用式Ia化合物与R5Y进行取代反应，得到式Ib化合物；

(c1)用式Ib化合物制备式Ib'化合物；

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权利要求书

3/4页

(c2)用式Ib'化合物制备式I化合物；

优选地，所述的方法还包括步骤：

(a)在有机溶剂中，用式1化合物和式2化合物反应，得到式3化合物；

式中，Y选自下组：氯、碘、溴、甲磺酸酯基、对甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基；其余各基团的定义如权利要求1中所述。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(d)：(d)在惰性溶剂中，在碱存在下，用式5化合物与式6化合物反应，得到式Ic化合物；

或所述方法包括步骤(e)和任选的步骤(f)：(e)在惰性溶剂中，在碱存在下，用式5化合物与式7化合物反应，得到式Id化合物；

(f)在惰性溶剂中，在氧化剂存在下，用式Id化合物与氧化剂反应，得到式Ie化合物；

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权利要求书

4/4页

式中，各基团的定义如权利要求1中所述。

6.如权利要求1所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐或水合物的用途，其特征在于，(a)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞生长；(b)制备治疗肿瘤的药物组合物；(c)体外非治疗性地抑制拓扑异构酶II的活性；(d)体外非治疗性地抑制微管蛋白的活性；(e)体外非治疗性地使细胞微管解聚；(f)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞的增殖生长；(g)制备具有拓扑异构酶II和微管蛋白双重抑制活性的药物组合物。

7.一种拓扑异构酶II活性抑制剂，所述的拓扑异构酶II活性抑制剂含有抑制有效量的如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。

8.一种细胞微管解聚剂，所述的细胞微管解聚剂含有解聚有效量的如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。

9.一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。

10.一种拓扑异构酶II和微管蛋白双重抑制剂，其特征在于，所述的抑制剂包括如权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。

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说明书

α-咔啉类化合物，其制备方法以及用途

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技术领域

本发明属于药物化学和药物治疗领域。具体涉及一类含有α-咔啉(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚)母核化合物，及其药学上可接受的盐及水合物，其制备方法及它们在治疗与拓扑异构酶Ⅱ以及微管蛋白相关疾病如肿瘤的药物中的应用。

[0001]

背景技术

DNA作为遗传信息的携带者，在整个生命过程中起到非常重要的作用。在DNA转

录、复制以及基因表达中，DNA拓扑异构酶对DNA复杂的拓扑结构的调控和维持使生命井然有序。自1971年J.C.Wang发现第一个可以改变DNA拓扑结构的ω蛋白以来，研究者对DNA拓扑异构酶进行了细致的研究。根据作用机制和生物结构的不同，DNA拓扑异构酶分为拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱ。真核生物拓扑异构酶Ⅱ为同源二聚体，包括两个亚型：Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ。二者的生理功能存在着较大差别:Topo Ⅱα倾向于对正超螺旋的DNA起作用，而Topo Ⅱβ并没有表现出对超螺旋DNA构象的特殊选择性；Topo Ⅱα对细胞增殖起重要作用，在细胞快速增殖期含量较高，因而可作为判断细胞增殖程度的标志物；Topo Ⅱβ在细胞中含量相对稳定，与细胞增殖状态及细胞周期无相关性。Topo Ⅰ在DNA双链上产生单链断裂，使另一单链从缺口处穿过，改变DNA超螺旋或螺旋化不足的情况。Topo Ⅱ与Topo Ⅰ断裂机理不同，它在DNA主链上产生双链断裂，使另一条双链DNA从缺口处穿过。除了能完成所有Topo Ⅰ的功能以外，Topo Ⅱ还能在DNA复制完成后分开相互交联的姐妹染色单体。DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂通过影响Topo Ⅱ酶作用过程的各个阶段来破坏酶的活性。它可以直接作用于DNA，也可以作用于拓扑异构酶Ⅱ，还可以作用于DNA拓扑异构酶Ⅱ-DNA断裂复合物，来完成对拓扑异构酶Ⅱ活性的抑制，并最终导致细胞凋亡。研究表明，大部分DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的细胞毒性是通过形成DNA-酶-药物三元复合物，阻断酶与DNA反应的最后一步即单链或双链DNA在切口部位的重新接合而实现的。抑制剂的作用实际上是使细胞内功能正常的拓扑异构酶Ⅱ转变为导致DNA链断裂的致伤物，而细胞死亡的最终原因可能是由于DNA链断裂的错误修复或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在，激活了细胞内一系列导致细胞程序性死亡的过程。基于对Topo Ⅱ在细胞中关键作用的认识，对拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的研究一直是抗肿瘤药物研发的热点之一。目前已上市的拓扑异构酶Ⅱ抑制剂有依托泊苷，替尼泊苷，多柔比星，伊达比星，表柔比星和米托蒽醌等。[0003] 微管是细胞骨架的主要组成部分，由α-微管蛋白和β-微管蛋白异二聚体组成，具有中空管状结构的特点。此外，还有一种γ微管蛋白，它不是微管的组成成分，但参与微管的组装。微管具有聚合和解聚的动力学特性，在维持细胞形态、细胞分裂、信号转导及物质输送等过程中起着重要作用。微管在细胞分裂前期聚合成为纺锤体，而纺锤体在有丝分裂中牵引染色体向两极移动进入两个子细胞中，完成细胞增殖。由于微管在细胞分裂中具有极其重要的作用，现已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点之一，作用于微管系统的微管蛋白抑制剂也已成为一类有效的抗肿瘤药物。微管蛋白抑制剂根据作用机制的不同分为两种类型：抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂和促进微管蛋白聚合的微管蛋白聚合剂。同时，

[0002]

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说明书

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根据微管蛋白抑制剂与微管蛋白作用位点的不同又可分为3类：作用于秋水仙碱位点的微管蛋白抑制剂，作用于长春碱位点的微管蛋白抑制剂和作用于紫杉醇位点的微管蛋白抑制剂。大量结构多样的微管蛋白抑制剂已被合成，且部分化合物表现出了很强的抗肿瘤作用。[0004] 临床上DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂和微管蛋白抑制剂经常联合用药用于治疗肿瘤，常见阿霉素，依托泊苷与长春新碱，紫杉醇联合用药治疗白血病，肺癌，乳腺癌和胃癌等。联合用药具有很多优点，例如，紫杉醇和阿霉素的联合用药不但对癌症的治疗起到协同作用，同时还能减少由于药物毒性引起的副作用。此外，联合用药在一定程度上还能减缓肿瘤的耐药性。显然，DNA拓扑异构酶Ⅱ和微管蛋白的双重抑制剂将比联合用药更为简便和易于控制。但现阶段还没有相关DNA拓扑异构酶Ⅱ和微管蛋白双重抑制剂的报导。[0005] α-咔啉(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚)是咔啉类化合物中的一种。上个世纪六七十年代，人们在骆驼蓬科植物骆驼蓬的种子中发现咔啉类生物碱-骆驼蓬碱具有多种生物学活性后，便引起了研究咔啉类衍生物的热潮。咔啉为吡啶并吲哚结构，根据吡啶氮原子的不同，在咔啉前缀上不同的希腊字母以示区别，其中β-咔啉类化合物在天然产物中最为常见，而α-咔啉类化合物研究相对较少。具有α-咔啉结构的天然产物大多具有很好的生物活性，因其与DNA的结合活性或者对Topo-Ⅱ的抑制活性展现出优良的抗病毒、抗癌活性。α-咔啉类化合物还具有抗抑郁和抗精神类疾病的作用。α-咔啉衍生物也可作为一些激酶抑制剂，如细胞周期依赖性激酶抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂等。此外，还报道α-咔啉类化合物有抗疟原虫活性。[0006] 综上所述，本领域迫切需要开发新的具有抗病毒、抗癌活性的α-咔啉衍生物。发明内容

本发明的目的是提供一种新的具有抗病毒、抗癌活性的α-咔啉衍生物。[0008] 本发明的第一方面，提供了一类具有如下通式Ⅰ所示结构的化合物：

[0007] [0009]

其中，[0011] R1、R2、R3、R4各自独立地选自下组：氢、卤素、硝基、氨基、羟基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C3-C6的环烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链亚烷基-胺基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基，以及取代或未取代的含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；[0012] R5选自下组：氢、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C3-C6的环烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链亚烷基-羟基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基，以及取代或未取代的含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；[0013] R6选自下组：氢、卤素、羟基、氨基、甲氨基、二甲氨基、取代或未取代的C1-C4的直

[0010]

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说明书

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链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基-氧基；[0014] R7选自下组：氢、卤素、羟基、氨基、甲基、甲氧基、甲氨基、二甲氨基，-OAc、甲氧羰基，乙酰氨基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基；[0015] R8选自下组：氢、卤素、羟基、氨基、甲基、甲氧基、甲氨基、二甲氨基、甲氧羰基、乙酰氨基、甲砜基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链烷氧基、取代或未取代的C1-C4的直链或支链胺基；

[0016]

X为链接基团，选自下组：亚甲基、氧、硫、羰基、亚砜基、砜基、

其中，所述的取代指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、C1-C8烷基-胺基、羟基、甲基胺基、氨基、C1-C8烷基-氧基。[0018] 在另一优选例中，所述的取代的烷基为被选自下组的取代基取代：含氧基团、含氮基团，或氟原子。

[0019] 在另一优选例中，R5选自下组：氢、羟乙基、N,N-二甲基氨基乙基；[0020] R6选自下组：氢、羟基、-NH-CH3、-NH2、-N(CH3)2、-O(CH2)2OH、-O(CH2)2N(CH3)2；[0021] R7选自下组：氢、氟、羟基、甲基、甲氧基、乙酰氨基、-OAc；[0022] R8选自下组：氢、氟、氯、溴、甲基、甲氧基、乙酰氨基、二甲氨基、甲砜基；

[0017] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039]

X选自下组：氧、硫、羰基、亚砜基、砜基、

在另一优选例中，R1为氢、卤素；

R2为氢、卤素、甲氧基、二甲胺基、吗啉基；R3为氢、卤素、甲氧基；R4为氢、卤素、甲氧基；R5为氢、羟乙基、N,N-二甲基氨基乙基；R6为H、-OH、-O(CH2)2OH、-O(CH2)2N(CH3)2、-NH-CH3、-N(CH3)2、-NH2；R7为H、卤素、-OCH3、-OH、-OAc；R8为H、卤素、甲基、-OCH3、-SO2-CH3、-N(CH3)2、-NHAc。在另一优选例中，R1为氢、氟；R2为氢、氟、氯、甲氧基、二甲胺基、吗啉基；R3为氢、氟、氯、甲氧基；R4为氢、氟、甲氧基；R5为氢、羟乙基、N,N-二甲基氨基乙基；R6为氢、羟基、氨基、甲胺基、二甲胺基、-O(CH2)2OH、-O(CH2)2N(CH3)2；R7为氢、氟、羟基、甲氧基、-OAc；R8为氢、氟、氯、溴、甲氧基、乙酰氨基、二甲氨基、甲砜基；

CN 105820165 A

说明书

4/47页

[0040] [0041]

X为链接的硫、甲氨基、羰基、亚砜基、砜基、

在另一优选例中，所述的化合物中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和X中任一个分别为实施例中所述具体化合物中所对应的基团。[0042] 在另一优选例中，所述的式I化合物具有选自下组的结构：

[0043]

[0044]

CN 105820165 A

说明书

5/47页

在另一优选例中，所述的化合物为选自下组的化合物：Ⅰ-4、Ⅰ-11、Ⅰ-16、Ⅰ-23、Ⅰ-28、Ⅰ-32、Ⅰ-33、Ⅰ-37、Ⅰ-36、Ⅰ-34、I-41。[0046] 本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的化合物的制备方法，包括步骤(b)和任选的(c)、(c1)和/或(c2)：[0047] (b)在有机溶剂中，在还原剂存在下，用式3化合物进行关环反应，得到式Ia化合物；

[0045] [0048]

CN 105820165 A

说明书

6/47页

[0049]

(c)在有机溶剂中，在碱存在下，用式Ia化合物与R5Y进行取代反应，得到式Ib化

合物；

[0050]

[0051] [0052]

(c1)用式Ib化合物制备式Ib'化合物；

[0053] [0054]

(c2)用式Ib'化合物制备式I化合物；

优选地，所述的方法还包括步骤：[0056] (a)在有机溶剂中，用式1化合物和式2化合物反应，得到式3化合物；

[0055] [0057]

CN 105820165 A[0058]

说明书

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式中，Y选自下组：氯、碘、溴、甲磺酸酯基、对甲苯磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基；其余各基团的定义如本发明第一方面中所述。[0059] 在另一优选例中，所述的步骤(a)在醋酐和/或醋酸钠存在下进行。[0060] 优选地，所述的式1化合物与醋酸钠的摩尔比为1:0.8-1.2。[0061] 优选地，所述的式1化合物与式2化合物的摩尔比为1:0.8-1.2。[0062] 在另一优选例中，所述的步骤(a)在四氯化钛和吡啶存在下进行(优选地，所述的式1化合物与四氯化钛的摩尔比为1:1-3)。[0063] 在另一优选例中，在所述步骤(a)中，所述的有机溶剂选自下组：醋酸酐、吡啶、四氢呋喃、二氧六环、DMF、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、氯仿，或其组合。[0064] 在另一优选例中，在所述步骤(a)中，所述的反应温度为70-100℃。[0065] 在另一优选例中，所述的步骤(b)中，所述的还原剂选自下组：氢气、铁粉、锌粉、硫化物；更佳地为铁粉或锌粉。[0066] 在另一优选例中，所述的步骤(b)在醋酸回流条件下进行。[0067] 在另一优选例中，在所述步骤(b)中，所述的有机溶剂选自下组：醋酸、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮，或其组合。[0068] 在另一优选例中，在所述步骤(b)中，所述的反应温度为90-130℃。[0069] 在另一优选例中，在所述步骤(c)中，所述的碱选自下组：氢化钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠，或其组合；优选为氢化钠。[0070] 在另一优选例中，在所述步骤(c)中，所述的反应温度为10-40℃(优选为室温)。[0071] 在另一优选例中，在所述步骤(c)中，所述的有机溶剂选自下组：N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃，或其组合。[0072] 本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的化合物的制备方法，所述方法包括步骤(d)：

[0073] (d)在惰性溶剂中，在碱存在下，用式5化合物与式6化合物反应，得到式Ic化合物；

[0074]

或所述方法包括步骤(e)和任选的步骤(f)：

[0076] (e)在惰性溶剂中，在碱存在下，用式5化合物与式7化合物反应，得到式Id化合物；

[0075] [0077]

CN 105820165 A

说明书

8/47页

[0078] (f)在惰性溶剂中，在氧化剂存在下，用式Id化合物与氧化剂反应，得到式Ie化合

物；

[0079]

[0080] 在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述的碱选自下组：叔丁醇钠，和/或叔丁醇

钾。

在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述的反应在过渡金属(优选Pd或Cu)存在下进行。

[0082] 在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述的反应在催化剂存在下进行；较佳地，所述的催化剂选自下组：0价钯、膦配体，或其组合。[0083] 在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述的反应温度为100-120℃。[0084] 在另一优选例中，在所述步骤(d)中，所述的惰性溶剂为叔丁醇。[0085] 在另一优选例中，在所述步骤(e)中，所述的碱选自下组：甲基锂、正丁基锂、叔丁基锂，或其组合；优选为甲基锂，叔丁基锂，或其组合。[0086] 在另一优选例中，在所述步骤(e)中，所述的反应温度为-80℃到室温(10～40℃)。

[0087] 在另一优选例中，在所述步骤(e)中，所述的惰性溶剂为无水四氢呋喃。[0088] 在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的氧化剂选自下组：三氧化铬/吡啶、三氧化铬/硫酸、Dess-Martin氧化剂或二氧化锰，或其组合；优选为Dess-Martin氧化剂。[0089] 在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的惰性溶剂为二氯甲烷。[0090] 在另一优选例中，在所述步骤(f)中，所述的反应温度为10-40℃(优选为室温)。[0091] 在另一优选例中，所述的方法还包括任选的步骤(d1)：用式Ic化合物制备式Ic'化合物；

[0081] [0092]

CN 105820165 A[0093]

说明书

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式中，X'选自下组：亚甲基、氧、硫、羰基、亚砜基、砜基、

且X'与X不同。

本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式I化合物，或其药学上可接受的盐或水合物的用途，用于(a)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞生长；(b)制备治疗肿瘤的药物组合物；(c)体外非治疗性地抑制拓扑异构酶II的活性；(d)体外非治疗性地抑制微管蛋白的活性；(e)体外非治疗性地使细胞微管解聚；(f)体外非治疗性地抑制肿瘤细胞的增殖生长；(g)制备具有拓扑异构酶II和微管蛋白双重抑制活性的药物组合物。[0095] 在另一优选例中，所述的肿瘤细胞选自下组：口腔癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞，或其组合。

[0096] 在另一优选例中，当所述的式I化合物被用于抑制肿瘤细胞增殖生长时，所述的抑制活性IC50值为1-2000nmol，优选为2-1000nmol，更优选为10-500nmol。[0097] 本发明的第五方面，提供了一种拓扑异构酶II活性抑制剂，所述的拓扑异构酶II活性抑制剂含有抑制有效量的如本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。

[0098] 本发明的第六方面，提供了一种细胞微管解聚剂，所述的细胞微管解聚剂含有解聚有效量的如本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。[0099] 本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的如本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。[0100] 在另一优选例中，所述的药物组合物是治疗肿瘤的药物组合物。[0101] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制拓扑异构酶II的活性。[0102] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于抑制微管蛋白的活性。[0103] 在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括：口服制剂、注射剂和外用制剂。[0104] 本发明的第八方面，提供了一种拓扑异构酶II和微管蛋白双重抑制剂，所述的抑制剂包括如本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐或水合物。[0105] 在另一优选例中，所述的双重抑制剂用于治疗肿瘤。[0106] 在另一优选例中，所述的双重抑制剂可抑制选自下组的蛋白的表达：MCL-1(myeloid cell leukemia-1)、cIAP1(cellular inhibitor of apoptosis protein-1)或XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)。[0107] 本发明的第九方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括步骤：给需要的对象施用安全有效量的如本发明第一方面中所述的化合物或如本发明第七方面所述的药物组合物。

[0108] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

[0094]

附图说明

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图1为化合物Ⅰ-4抗肿瘤瘤谱；

[0110] 图2为化合物Ⅰ-4对细胞微管的作用(图中标尺长度指示10μM)；[0111] 图3为化合物Ⅰ-4对Top2酶活性抑制作用；

[0112] 图4为化合物Ⅰ-4与联合用药在HeLa细胞中的区别。

具体实施方式

[0113] 本发明人经过长期而深入的研究，提供了一类具有如式I所示结构的化合物，所述的化合物可以抑制拓扑异构酶II的kDNA解螺旋活性，同时促使细胞微管蛋白解聚，进而抑制肿瘤细胞的生长。基于上述发现，发明人完成了本发明。[0114] 术语

[0115] 在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：C1～C10烷基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、卤素、羟基、羧基(-COOH)、C1～C10醛基、C2～C10酰基、C2～C10酯基、氨基、苯基；所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3个取代基的取代苯基，所述取代基选自：卤素、C1-C10烷基、氰基、OH、硝基、C3～C10环烷基、C1～C10烷氧基、氨基。[0116] 除特别说明之处，本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。[0117] 术语“C1～C4烷基”指具有1～4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。[0118] 术语“C3～C6环烷基”指具有3～6个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环庚基、或类似基团。[0119] 术语“C1～C4烷氧基”指具有1-4个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。[0120] 术语“卤素”指F、Cl、Br和I。[0121] 术语“C1～C4胺基”指具有“C1～C4烷基-NH-”或“(烷基)2-N-(碳原子总数为1-4)”结构的基团，例如CH3NH-、C2H5NH-、C3H7NH-、(CH3)2N-，或类似基团。其中，C1～C4烷基的定义如前所述。[0122] 术语“C1～C4亚烷基-胺基”指具有“C1～C4亚烷基-NH2”“烷基-N-亚烷基-(碳、原子总数为1-4)”、或“(烷基)2-N-亚烷基-(碳原子总数为1-4)”结构的基团，例如-CH2NH2、-C2H5NH2、-C3H7NH2、-C2H4N(CH3)2，或类似基团。其中，C1～C4亚烷基为C1～C4烷基失去一个氢原子形成的基团，C1～C4烷基的定义如前所述。[0123] 式I化合物

[0124] 本发明的目的是提供一类通式Ⅰ含有α-咔啉(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚)母核的化合物或其药学上可接受的盐或水合物。

[0125] 其中，

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R1、R2、R3、R4单独或同时为氢，卤素，C1-C4的直链或支链烷基，C3-C6的环烷基，含氧、氮或氟的C1-C4的直链或支链烷基、醇或胺，以及含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；[0127] R5为氢，C1-C4的直链或支链烷基，C3-C6的环烷基，含氧或氮的C1-C4的直链或支链烷基、醇或胺，以及含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；[0128] R6为氢，卤素，羟基，氨基，甲氨基，二甲氨基，含氧或氮的C1-C4的直链或支链烷基、醇或胺；

[0129] R7为氢，卤素，羟基，氨基，甲氧基，甲氨基，二甲氨基，甲氧羰基，乙酰氨基，含氧或氮的C1-C4的直链或支链烷基、醇或胺；[0130] R8为氢，卤素，羟基，氨基，甲氧基，甲氨基，二甲氨基，甲氧羰基，乙酰氨基，甲砜基，含氧或氮的C1-C4的直链或支链烷基、醇或胺；

[0131]

X为链接基团，可以是亚甲基，氧，硫，羰基，亚砜基，砜基，

优选地，[0133] R1、R2、R3、R4单独或同时为氢，卤素，C1-C4的直链或支链烷基，C3-C6的环烷基，含氧、氮或氟的C1-C4的直链或支链烷基、醇或胺，以及含氧或氮的饱和五元或六元杂环基；[0134] R5为氢，羟乙基，N,N-二甲基氨基乙基；[0135] R6为氢，羟基，氨基，甲氨基，二甲氨基，-O(CH2)2OH，-O(CH2)2N(CH3)2；[0136] R7为氢，氟，羟基，甲氧基，甲氧羰基，乙酰氨基；[0137] R8为氢、氟、氯、溴、甲氧基、乙酰氨基、二甲氨基、甲砜基；

[0132] [0138] [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144]

X为链接的氧，硫，羰基，亚砜基，砜基，

更优选地，

R1为氢，氟；R2为氢，氟，氯，甲氧基，二甲胺基，吗啉基；R3为氢，氟，氯，甲氧基；R4为氢，氟，甲氧基；

R5为氢，羟乙基，N,N-二甲基氨基乙基；

[0145] R6为氢，羟基，胺基，甲胺基，二甲胺基，-O(CH2)2OH，-O(CH2)2N(CH3)2；[0146] R7为氢，氟，羟基，甲氧基、甲氧羰基；[0147] R8为氢、氟、氯、溴、甲氧基、乙酰氨基、二甲氨基、甲砜基；

[0148] [0149] [0150]

X为链接的硫，甲氨基，羰基，亚砜基，砜基，最优选的，本发明提供了如下所示化合物：

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[0151]

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[0152]

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式Ⅰ化合物的制备

[0154] 本发明的另一目的是提供通式Ⅰ所示化合物的制备方法，合成路线如方案1或2所示：

[0155] 方案1

[0153] [0156]

[0157] a)使化合物1(3-醛基色酮)与化合物2(邻硝基苯乙腈)，在一定条件下缩合生

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成化合物3，所述条件为醋酐/醋酸钠体系,或者四氯化钛/吡啶体系；[0158] b)化合物3在还原剂(氢气，铁粉，锌粉，硫化物)作用下加热关环生成化合物4/Ⅰ。

[0159] c)化合物4在碱(氢化钠，叔丁醇钾，叔丁醇钠)作用下取代进一步生成化合物Ⅰ。

[0160] 优选地，所述步骤a)条件为：化合物1与化合物2溶于醋酸酐，在醋酸钠作用下70-100℃搅拌过夜反应，薄层色谱检测反应完全。[0161] 所述步骤b)条件为：化合物3在铁粉或锌粉还原下，醋酸回流反应，薄层色谱检测反应完全。

[0162] 所述步骤c)条件为：化合物4在氢化钠作用下，室温取代生成化合物Ⅰ。[0163] 方案2

[0164]

d)使化合物5与化合物6在碱存在下过渡金属(Pd或Cu)/配体催化偶联生成化

合物Ⅰ；

[0166] e)使化合物5与芳香醛7在强碱(甲基锂、正丁基锂或叔丁基锂)条件下生成化合物8/Ⅰ；

[0167] f)使部分化合物8在氧化剂(三氧化铬/吡啶、三氧化铬/硫酸、Dess-Martin氧化剂或二氧化锰)作用下进一步氧化为终产Ⅰ。[0168] 优选地，所述步骤d)条件为：化合物7与化合物8以叔丁醇为溶剂，叔丁醇钠作碱，0价钯、膦配体作催化剂，100-120℃反应至薄层色谱检测反应完全。[0169] 所述步骤e)条件为：无水四氢呋喃为溶剂，甲基锂，叔丁基锂作碱，-80℃到室温反应。

[0170] 所述步骤f)条件为：二氯甲烷作溶剂，氧化剂为Dess-martin氧化剂，室温反应至薄层色谱检测反应完全。[0171] 式I化合物的用途

[0172] 发明人设计合成了一类含有如式I所示的α-咔啉母核的拓扑异构酶Ⅱ和微管蛋

[0165]

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白双重抑制剂。所述的式I化合物具有明确的构效关系，部分化合物显示了很强的细胞增殖抑制作用，如化合物I-4，I-32，I-33等。该类新结构的α-咔啉类化合物有望成为新型抗肿瘤药物，所述肿瘤包括口腔癌，肺癌，肝癌，白血病，胃癌，宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌和前列腺癌等。[0173] 特别地，所述的式I化合物在诱导凋亡实验中，表现出的作用机制不同于拓扑异构酶II抑制剂(如依托泊苷)和微管蛋白抑制剂(如长春新碱)的联合用药，具体地，所述的双重抑制剂可抑制选自下组的蛋白的表达：MCL-1(myeloid cell leukemia-1)、cIAP1(cellular inhibitor of apoptosis protein-1)或XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)，而在联合用药中观察不到上述的蛋白被抑制。[0174] 药物组合物和施用方法

[0175] 由于本发明化合物具有优异的对拓扑异构酶Ⅱ和微管蛋白的双重抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由与拓扑异构酶Ⅱ和/或微管蛋白活性或表达量相关的疾病，尤其适用于与拓扑异构酶Ⅱ和微管蛋白活性或表达量均相关的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：口腔癌，肺癌，肝癌，白血病，胃癌，宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌和前列腺癌等等。

[0176] 本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。[0177] “药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

[0178] 本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。[0179] 用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

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固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。[0181] 用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

[0182] 除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。

[0183] 除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

[0184] 用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。[0185] 用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

[0186] 本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。[0187] 使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。[0188] 与现有技术相比，本发明的主要优点包括：[0189] (1)提供了一类结构新颖的化合物，所述的化合物同时具有拓扑异构酶II的抑制活性和微管蛋白抑制活性。

[0190] (2)提供了一种具有肿瘤抑制活性的化合物，所述的化合物可以用于制备治疗肿瘤的药物。

[0191] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0192] 下面结合实施例对本发明所涉及化合物的结构和制备方法及体外抑制肿瘤细胞的活性作进一步阐述，但不限制本发明。[0193] 所有实施例中，起始化合物1、化合物2、化合物5化合物6以及化合物7购于上海书亚医药科技有限公司、韶远科技(上海)有限公司、北京百灵威科技有限公司、上海晶纯生化科技股份有限公司、上海泰坦科技有限公司。钯催化剂及膦配体购自北京百灵威科技有限公司。除特殊说明外，其他起始试剂、溶剂、材料均来源于国药试剂集团公司。1H NMR由BrucherAM-400型或GEMINI-300型核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示。质谱由

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Agilent1200-6110型单四级杆液相色谱质谱联用仪记录。分离用200-300目硅胶由青岛海洋化工厂提供。其中英文缩写所代表的化学试剂如下：[0194] DMF N,N-二甲基甲酰胺[0195] PPA 多聚磷酸[0196] THF 四氢呋喃

[0197] mCPBA 间氯过氧苯甲酸[0198] DCM 二氯甲烷[0199] dba 二亚苄基丙酮

[0200] Xphos 2-双环己基膦-2’,4’,6’-三异丙基联苯[0201] TMS 三甲基硅基[0202] 化合物的制备与合成

[0203] 实施例1 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3a)的制备

[0204]

于25mL圆底烧瓶中，加入化合物3-醛基-色酮1a 100mg(0.574mmol)，邻硝基苯

乙腈93mg(0.574mmol)，醋酸钠47mg(0.574mmol)，醋酸酐5mL，于90℃油浴锅中搅拌加热过夜。次日降温至室温，倒入150mL冰水中淬灭反应。50mL DCM萃取三次，合并有机相后50mL饱和食盐水洗涤，然后无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝4:1)得浅黄色固体162mg，收率88％。

[0206] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.03(s,1H),8.27(d,J＝9.4Hz,1H),8.18(d,J＝8.1Hz,1H),7.82–7.41(m,8H).[0207] LC-MS：319(M+1)。

[0208] (2-羟基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-1)的制备

[0205] [0209]

于25mL圆底烧瓶中，加入5mL醋酸，化合物3a 100mg(0.314mmol)，铁粉

106mg(1.89mmol)，加热回流反应2小时。冷却至室温后将反应体系倒入200mL水中，50mL DCM萃取三次，合并有机相，随后用50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)得浅黄色固体58mg，收率64％。

[0211] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.30(s,1H),10.32(s,1H),8.88(s,1H),8.73(s,1H),8.29(d,J＝7.9Hz,1H),7.62–7.38(m,4H),7.28(t,J＝7.9Hz,1H),7.10–6.91(m,2H).[0212] LC-MS：289(M+1)。

[0210]

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实施例2 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(6-甲基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3b)的制备

[0214]

95mg(0.5mmol)3-醛基6-甲基色酮1b为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅黄

色固体146mg，收率88％。

[0216] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.01(s,1H),8.18(d,J＝8.2Hz,1H),8.04(s,1H),7.79–7.71(m,1H),7.69–7.52(m,4H),7.46(d,J＝8.6Hz,1H),2.49(s,3H).[0217] LC-MS：333(M+1)。

[0218] (2-羟基-5-甲基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-2)的制备

[0215] [0219]

[0220] 100mg(0.3mmol)3b为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得黄色固体52mg，收率

58％。

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.62(s,1H),12.11(s,1H),8.68(d,J＝

7.7Hz,1H),8.19(d,J＝8.7Hz,1H),8.05–7.95(m,1H),7.91(s,1H),7.57–7.42(m,2H),7.33–7.21(m,1H),7.11(d,J＝6.8Hz,1H),6.85(d,J＝7.9Hz,1H),2.32(s,3H).[0222] LC-MS：303(M+1)。

[0223] 实施例3 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(7-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3c)的制备

[0221] [0224]

103mg(0.5mmol)3-醛基7-甲氧基色酮1c为原料，参考化合物3a的合成过程，得

浅黄色固体125mg，收率72％。

[0226] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.96(s,1H),8.22–8.13(m,2H),7.79–7.58(m,3H),7.54(s,1H),7.04(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.93(d,J＝2.3Hz,1H),3.95(s,3H).

[0225]

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LC-MS：349(M+1)。

[0228] (2-羟基-4-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-3)的制备

[0229]

[0230] 105mg(0.3mmol)3c为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得白色固体74mg，收率

78％。

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.30(s,1H),12.10(s,1H),8.67(d,J＝

8.4Hz,1H),8.18(d,J＝8.8Hz,1H),8.02(d,J＝8.5Hz,1H),7.58(d,J＝2.4Hz,2H),7.56–7.42(m,2H),7.25(t,J＝7.4Hz,1H),6.95–6.82(m,2H),3.79(s,3H).[0232] LC-MS：319(M+1)。

[0233] 实施例4 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3d)的制备

[0231] [0234]

103mg(0.5mmol)6-甲氧基-3-醛基-色酮1d为原料，参考化合物3a的合成过程，

得浅黄色固体152mg，收率87％。

[0236] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.86(s,1H),8.17(d,J＝9.1Hz,1H),7.81–7.49(m,5H),7.10(d,J＝8.4Hz,1H),6.89(d,J＝9.4Hz,1H),4.00(s,3H).[0237] LC-MS：349(M+1)。

[0238] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-4)的制备

[0235] [0239]

[0240] 105mg(0.3mmol)3d为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得白色固体57mg，收率

60％。

[0241]

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H),9.73(s,1H),8.89(s,1H),8.73(

s,1H),8.30(d,J＝8.1Hz,1H),7.61–7.45(m,2H),7.28(t,J＝8.2Hz,1H),7.12–

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说明书

21/47页

7.03(m,1H),6.99–6.87(m,2H),3.72(s,3H).[0242] LC-MS：319(M+1)。

[0243] 实施例5 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(6-氟-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3e)的制备

[0244]

97mg(0.5mmol)6-氟-3-醛基-色酮1e为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅

黄色固体152mg，收率90％。

[0246] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(s,1H),8.19(dd,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.90(dd,J＝8.0,3.0Hz,1H),7.76(td,J＝7.5,1.4Hz,1H),7.70–7.56(m,3H),7.53–7.45(m,2H).[0247] LC-MS：337(M+1)。

[0245] [0248]

(2-羟基-5-氟苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-5)

的制备

[0249]

101mg(0.3mmol)3e为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体60mg，收率65％。

[0251] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.68(s,1H),12.17(s,2H),8.74–8.65(m,1H),8.21(d,J＝7.7Hz,1H),8.05(d,J＝8.4Hz,1H),7.97(d,J＝13.8Hz,1H),7.60–7.42(m,2H),7.28(t,J＝7.4Hz,1H),7.20–7.11(m,1H),7.02–6.89(m,1H).

[0252] LC-MS：307(M+1)。

[0253] 实施例6 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(6-氯-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3f)的制备

[0250] [0254]

105mg(0.5mmol)6-氯-3-醛基-色酮1f为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅

黄色固体162mg，收率92％。

[0256] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(s,1H),8.23(d,J＝2.6Hz,1H),7.80–

[0255]

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说明书

22/47页

7.57(m,5H),7.55(s,1H),7.53–7.48(m,1H).[0257] LC-MS：353(M+1)。

[0258] (2-羟基-5-氯苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-6)的制备

[0259]

[0260] 106mg(0.3mmol)3f为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得黄色固体62mg，收率

64％。

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.90(s,1H),12.18(s,1H),8.71(d,J＝

8.4Hz,1H),8.31–8.14(m,2H),8.09(d,J＝9.2Hz,1H),7.63–7.44(m,2H),7.42–7.21(m,2H),6.99(d,J＝8.8Hz,1H).[0262] LC-MS：323(M+1)。

[0263] 实施例7 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(6-溴-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3g)的制备

[0261] [0264]

127mg(0.5mmol)6-溴-3-醛基-色酮1g为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅

黄色固体173mg，收率87％。

[0266] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(s,1H),8.39(d,J＝2.4Hz,1H),8.19(d,J＝8.3Hz,1H),7.90–7.55(m,4H),7.54–7.43(m,2H).[0267] LC-MS：397(M+1)，399(M+3)。

[0268] (2-羟基-5-溴苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-7)的制备

[0265] [0269]

[0270] 120mg(0.3mmol)3g为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得黄色固体63mg，收率

57％。

[0271]

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H),10.33(s,1H),8.88(s,1H),8.73(s,1H),

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说明书

23/47页

8.30(d,J＝8.4Hz,1H),7.65–7.46(m,4H),7.34–7.23(m,1H),6.97(d,J＝8.6Hz,1H).[0272] LC-MS：367(M+1)，369(M+3)。

[0273] 实施例8 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(7-氟-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3h)的制备

[0274]

97mg(0.5mmol)7-氟-3-醛基-色酮1h为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅

黄色固体151mg，收率90％。

[0276] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.99(s,1H),8.29(dd,J＝8.9,6.2Hz,1H),8.19(d,J＝8.3Hz,1H),7.80–7.71(m,1H),7.70–7.56(m,2H),7.50(s,1H),7.26–7.14(m,2H).[0277] LC-MS：337(M+1)。

[0278] (2-羟基-4-氟苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-8)的制备

[0275] [0279]

[0280] 101mg(0.3mmol)3h为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得黄色固体42mg，收率

45％。

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.16(s,1H),8.70(d,J＝8.4Hz,1H),8.18(t,J＝

8.9Hz,2H),7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.60–7.42(m,2H),7.27(t,J＝8.0Hz,1H),6.88–6.71(m,2H).

[0282] LC-MS：307(M+1)。

[0283] 实施例8 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(7-羟基-6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3i)的制备

[0281] [0284]

110mg(0.5mmol)7-羟基-6-甲氧基-3-醛基-色酮1i为原料，参考化合物3a的

合成过程，得浅黄色固体118mg，收率65％。

[0286] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.01(s,1H),8.19(d,J＝8.8Hz,1H),7.85–

[0285]

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说明书

24/47页

7.57(m,4H),7.52(s,1H),7.33(s,1H),3.96(s,3H),2.38(s,3H).[0287] LC-MS：365(M+1)。

[0288] 5-羟基-2-甲氧基-4-(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-羰基)苯基乙酸酯(化合物Ⅰ-9)的制备

[0289]

100mg(0.274mmol)3i为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得黄色固体45mg，收

率44％。

[0291] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.29(s,1H),10.10(s,1H),8.92(s,1H),8.76(s,1H),8.40–8.24(m,2H),7.62–7.43(m,1H),7.35–7.23(m,1H),7.16(s,1H),6.77(s,1H),3.73(s,3H),2.30(s,3H).[0292] LC-MS：377(M+1)。

[0293] 实施例9 (2,4-二羟基-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-10)的制备

[0290] [0294]

5mL圆底烧瓶，加入90mg(0.239mmol)Ⅰ-9，95.6mg(2.39mmol)NaOH，4mL THF，1mL

水，室温搅拌过夜反应，次日150mL水稀释，50mL DCM萃取三次，合并有机相，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝4:1)得浅黄色固体25mg，收率31％。

[0296] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.23(s,1H),11.68(s,2H),8.90(s,1H),8.75(s,1H),8.32(d,J＝7.3Hz,1H),7.63–7.46(m,2H),7.37–7.20(m,1H),7.08(s,1H),6.47(s,1H),3.68(s,3H).

[0297] LC-MS：335(M+1)。

[0298] 实施例11 (E/Z)-2-(2-硝基苯)-3-(6,7-二甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3j)的制备

[0295] [0299]

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说明书

25/47页

200mg(0.854mmol)6,7-二甲氧基-3-醛基-色酮1j为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅黄色固体142mg，收率44％。

[0301] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.98(s,1H),8.17(d,J＝9.1Hz,1H),7.81–7.53(m,5H),6.95(s,1H),4.03(s,3H),4.00(s,3H).[0302] LC-MS：379(M+1)。

[0303] (2-羟基-4,5-二甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-11)的制备

[0300] [0304]

135mg(0.357mmol)3j为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得黄色固体85mg，收

率68％。

[0306] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.24(s,1H),11.58(s,1H),8.91(s,1H),8.76(s,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.62–7.45(m,2H),7.35–7.22(m,1H),7.09(s,1H),6.67(s,1H),3.87(s,3H),3.67(s,3H).[0307] LC-MS：349(M+1)。

[0308] 实施例12 (E/Z)-2-(4,5-二甲氧基硝基苯基)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3k)的制备

[0305] [0309]

102mg(0.5mmol)1d，111mg(0.5mmol)2b为原料，参考化合物3a的合成过程，得黄

色固体150mg，收率74％。

[0311] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(s,1H),7.76(s,1H),7.60(d,J＝3.2Hz,1H),7.54–7.44(m,2H),7.39–7.31(m,1H),6.90(s,1H),4.04(s,3H),4.01(s,3H),3.92(s,3H).

[0312] LC-MS：409(M+1)。

[0313] (6,7-二甲氧基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)(2-羟基-5甲氧基苯基)甲

[0310]

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说明书

26/47页

酮(化合物Ⅰ-12)的制备

[0314]

100mg(0.245mmol)3k为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体54mg，收率58％。

[0316] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ11.46(s,1H),9.67(s,1H),8.80(s,1H),8.62(s,1H),7.53(s,1H),7.24–7.16(m,2H),7.12–7.02(m,2H),4.02(s,3H),4.01(s,3H),3.74(s,3H).

[0317] LC-MS：379(M+1)。

[0318] 实施例13 (E/Z)-2-(4-甲氧基硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3l)的制备

[0315] [0319]

102mg(0.5mmol)1d，96mg(0.5mmol)2c为原料，参考化合物3a的合成过程，得类白

色固体122mg，收率64％。

[0321] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.99(s,1H),7.67(d,J＝2.9Hz,1H),7.60(d,J＝3.0Hz,1H),7.53–7.45(m,3H),7.33(dd,J＝9.2,3.0Hz,1H),7.23(d,J＝2.6Hz,1H),3.94(s,3H),3.92(s,3H).[0322] LC-MS：379(M+1)。

[0323] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(7-甲氧基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-13)的制备

[0320] [0324]

100mg(0.265mmol)3l为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体50mg，

收率54％。

[0326] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),9.72(s,1H),8.75(s,1H),8.63(s,1H),8

[0325]

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说明书

27/47页

.17(d,J＝8.8Hz,1H),7.12–6.81(m,5H),3.86(s,3H),3.72(s,3H).[0327] LC-MS：349(M+1)。

[0328] 实施例14 (E/Z)-2-(4-氯-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3m)的制备

[0329]

102mg(0.5mmol)1d，98mg(0.5mmol)2d为原料，参考化合物3a的合成过程，得类白

色固体132mg，收率69％。

[0331] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(s,1H),8.17(s,1H),7.73(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),7.62–7.46(m,4H),7.34(dd,J＝9.2,2.9Hz,1H),3.93(s,3H).[0332] LC-MS：383(M+1)。

[0333] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(7-氯-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-14)的制备

[0330] [0334]

100mg(0.262mmol)3m为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体63mg，

收率68％。

[0336] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,1H),9.72(s,1H),8.75(s,1H),8.63(s,1H),8.17(d,J＝8.8Hz,1H),7.12–6.81(m,5H),3.86(s,3H),3.72(s,3H).[0337] LC-MS：353(M+1)。

[0338] 实施例15 (E/Z)-2-(4-氟-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3n)的制备

[0335] [0339]

102mg(0.5mmol)1d，90mg(0.5mmol)2e为原料，参考化合物3a的合成过程，得黄色

固体170mg，收率93％。

[0341] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.01(s,1H),7.92(dd,J＝8.1,2.7Hz,1H),7.63–7.55(m,2H),7.55–7.45(m,3H),7.40–7.31(m,1H),3.93(s,3H).[0342] LC-MS：367(M+1)。

[0340]

CN 105820165 A[0343]

说明书

28/47页

(2-羟基-5-甲氧基苯基)(7-氟-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-15)的制备

[0344]

100mg(0.273mmol)3n为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体55mg，

收率60％。

[0346] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.01(s,1H),7.92(dd,J＝8.1,2.7Hz,1H),7.63–7.55(m,1H),7.55–7.45(m,1H),7.40–7.31(m,4H),3.93(s,3H).[0347] LC-MS：337(M+1)。

[0345]

实施例16 (E/Z)-2-(5-氟-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3o)的制备

[0348] [0349]

102mg(0.5mmol)1d，90mg(0.5mmol)2f为原料，参考化合物3a的合成过程，得类白

色固体135mg，收率74％。

[0351] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.01(s,1H),8.38–8.26(m,1H),7.81–7.58(m,5H),7.50(d,J＝6.0Hz,1H),3.89(s,3H).[0352] LC-MS：367(M+1)。

[0353] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(6-氟-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-16)的制备

[0350] [0354]

100mg(0.273mmol)3o为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体58mg，

收率63％。

[0356] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.34(s,1H),9.73(s,1H),8.95(s,1H),8.75(s,1H),8.22(d,J＝11.9Hz,1H),7.61–7.46(m,1H),7.46–7.27(m,1H),7.18–7.02(m,1H),6.99–6.88(m,2H),3.73(s,3H).

[0355]

CN 105820165 A[0357]

说明书

29/47页

LC-MS：337(M+1)。

[0358] 实施例17 (E/Z)-2-(6-氟-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3p)的制备

[0359]

102mg(0.5mmol)1d，90mg(0.5mmol)2g为原料，参考化合物3a的合成过程，得类白

色固体165mg，收率90％。

[0361] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.06(s,1H),7.99(d,J＝9.4Hz,1H),7.68–7.47(m,5H),7.38–7.30(m,1H),3.92(s,3H).[0362] LC-MS：367(M+1)。

[0363] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(5-氟-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-17)的制备

[0360] [0364]

130mg(0.355mmol)3p为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体60mg，

收率50％。

[0366] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.63(s,1H),9.75(s,1H),8.81(s,1H),8.63(s,1H),7.60–7.36(m,2H),7.16–6.89(m,4H),3.72(s,3H).[0367] LC-MS：337(M+1)。

[0368] 实施例18 (E/Z)-2-(3-甲氧基-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3q)的制备

[0365] [0369]

102mg(0.5mmol)1d，97mg(0.5mmol)2h为原料，参考化合物3a的合成过程，得类白

色固体120mg，收率63％。

[0371] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.89(s,1H),7.64–7.45(m,4H),7.37–7.29(m,1H),7.15(t,J＝7.8Hz,2H),3.96(s,3H),3.91(s,3H).[0372] LC-MS：379(M+1)。

[0373] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(8-甲氧基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-18)的制备

[0370]

CN 105820165 A[0374]

说明书

30/47页

100mg(0.265mmol)3q为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体48mg，收率52％。

[0376] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.43(s,1H),9.73(s,1H),8.85(s,1H),8.73(s,1H),7.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.28–6.86(m,5H),3.99(s,3H),3.72(s,3H).[0377] LC-MS：349(M+1)。

[0378] 实施例19 (E/Z)-2-(5-氯-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3r)的制备

[0375] [0379]

102mg(0.5mmol)1d，97mg(0.5mmol)2i为原料，参考化合物3a的合成过程，得黄色

固体168mg，收率88％。

[0381] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.03(s,1H),8.15(d,J＝9.1Hz,1H),7.66–7.48(m,5H),7.41–7.31(m,1H),3.93(s,3H).[0382] LC-MS：383(M+1)。

[0383] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(6-氯-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-19)的制备：

[0380] [0384]

145mg(0.265mmol)3r为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体82mg，

收率61％。

[0386] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),9.76(s,1H),8.99(s,1H),8.78(s,1H),8.48(s,1H),7.63–7.43(m,2H),7.15–7.05(m,1H),7.02–6.86(m,2H),3.74(s,3H).[0387] LC-MS：353(M+1)。

[0388] 实施例20 (E/Z)-2-(3-氟-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3s)的制备

[0385] [0389]

CN 105820165 A

说明书

31/47页

102mg(0.5mmol)1d，91mg(0.5mmol)2j为原料，参考化合物3a的合成过程，得白色固体135mg，收率74％。

[0391] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.95(s,1H),7.68–7.56(m,2H),7.54–7.45(m,1H),7.46–7.30(m,3H),3.92(s,3H).[0392] LC-MS：367(M+1)。

[0393] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(8-氟-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-20)的制备

[0390] [0394]

115mg(0.314mmol)3s为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体33mg，

收率31％。

[0396] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.82(s,1H),9.76(s,1H),8.95(s,1H),8.79(s,1H),8.16(d,J＝7.8Hz,1H),7.48–7.35(m,1H),7.33–7.20(m,1H),7.12–7.04(m,1H),7.02–6.90(m,2H),3.73(s,3H).[0397] LC-MS：337(M+1)。

[0398] 实施例21 (E/Z)-2-(5-甲氧基-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3t)的制备

[0395] [0399]

102mg(0.5mmol)1d，97mg(0.5mmol)2k为原料，参考化合物3a的合成过程，浅黄色

固体158mg，收率84％。

[0401] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(d,J＝0.9Hz,1H),8.24(d,J＝9.1Hz,1H),7.60(d,J＝3.1Hz,1H),7.53–7.48(m,2H),7.34(dd,J＝

[0400]

9.2,3.1Hz,1H),7.05(dd,J＝9.1,2.8Hz,1H),6.99(d,J＝2.7Hz,1H),3.97(s,3H),3.93(s,3H).

[0402] LC-MS：379(M+1)。

[0403] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(6-甲氧基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-21)的制备

CN 105820165 A[0404]

说明书

32/47页

125mg(0.331mmol)3t为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体52mg，收率45％。

[0406] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.13(s,1H),9.74(s,1H),8.90(s,1H),8.74(s,1H),7.93(d,J＝2.5Hz,1H),7.46(d,J＝8.8Hz,1H),7.21–7.03(m,2H),7.03–6.90(m,2H),3.85(s,3H),3.74(s,3H).[0407] LC-MS：349(M+1)。

[0408] 实施例22 (E/Z)-3-(6-(甲砜基)-4-氧-4H-色酮-3-取代)-2-(2-硝基苯)丙烯腈(化合物3u)的制备

[0405] [0409]

100mg(0.397mmol)1k为原料，参考化合物3a的合成过程，得浅黄色固体82mg，收

率52％。

[0411] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.0Hz,1H),8.87(d,J＝2.3Hz,1H),8.30(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.21(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.80–7.75(m,2H),7.62–7.58(m,2H),7.48–7.46(m,1H),3.15(s,3H).[0412] LC-MS：397(M+1)。

[0413] (2-羟基-5-(甲砜基)苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-22)的制备

[0410] [0414]

100mg(0.253mmol)3u为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得白色固体32mg，收

率35％。

[0416] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.37(s,1H),11.23(s,1H),8.93(s,1H),8.76(s,1H),8.32(d,J＝7.7Hz,1H),8.04–7.88(m,2H),7.64–7.48(m,2H),7.37–7.14(m,2H),3.23(s,3H).

[0415]

CN 105820165 A[0417]

说明书

33/47页

LC-MS：367(M+1)。

[0418] 实施例23 (E/Z)-2-(5-二甲氨基-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3v)的制备

[0419]

102mg(0.5mmol)1d，103mg(0.5mmol)2l为原料，参考化合物3a的合成过程，浅黄

色固体122mg，收率62％。

[0421] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(d,J＝1.0Hz,1H),8.21(d,J＝9.4Hz,1H),7.60(d,J＝3.0Hz,1H),7.53–7.48(m,1H),7.44(d,J＝1.0Hz,1H),7.34(dd,J＝9.2,3.0Hz,1H),6.68(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),6.56(d,J＝2.9Hz,1H),3.92(s,3H),3.17(s,6H).

[0420]

LC-MS：392(M+1)。

[0423] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(6-二甲氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-23)的制备

[0422] [0424]

100mg(0.256mmol)3v为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得红色固体39mg，收

率42％。

[0426] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.92(s,1H),9.71(s,1H),8.83(s,1H),8.67(s,1H),7.65(s,1H),7.39(d,J＝8.7Hz,1H),7.15–7.03(m,2H),6.99–6.86(m,2H),3.72(s,3H),2.94(s,6H).

[0427] LC-MS：362(M+1)。

[0428] 实施例24 (E/Z)-2-(5-吗啉基-2-硝基苯)-3-(6-甲氧基-4-氧-4H-色酮-3-取代)丙烯腈(化合物3w)的制备

[0425] [0429]

[0430] 102mg(0.5mmol)1d，124mg(0.5mmol)2m为原料，参考化合物3a的合成过程，白色

CN 105820165 A

说明书

34/47页

固体177mg，收率82％。

[0431] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.02(s,1H),8.21(d,J＝9.3Hz,1H),7.60(d,J＝3.1Hz,1H),7.53–7.43(m,2H),7.34(dd,J＝9.2,3.1Hz,1H),6.89(dd,J＝9.3,2.8Hz,1H),6.79(d,J＝2.8Hz,1H),3.92(s,3H),3.91–3.85(m,4H),3.48–3.39(m,4H).

[0432] LC-MS：434(M+1)。

[0433] (2-羟基-5-甲氧基苯基)(6-吗啉基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-24)的制备

[0434]

100mg(0.231mmol)3w为原料，参考化合物Ⅰ-1的合成过程，得类白色固体52mg，

收率56％。

[0436] H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.05(s,1H),9.72(s,1H),8.86(s,1H),8.72(s,1H),7.88(s,1H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.25(d,J＝8.7Hz,1H),7.06(dd,J＝8.8,2.9Hz,1H),6.98–6.92(m,2H),3.79(s,4H),3.73(s,3H),3.14(s,4H).[0437] LC-MS：404(M+1)。

[0438] 实施例25 N-(3-甲氧基苯基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-胺(化合物Ⅰ-26)的制备

[0435] [0439]

于25mL圆底烧瓶中，加入5mL叔丁醇，100mg(0.404mmol)3-溴-9H-吡啶并

[2,3-b]吲哚(化合物5)，65mg(0.526mmol)3-甲氧基苯胺(化合物6a)，30mg(0.042mmol)Pd2dba3，31mg(0.084mmol)Xphos，117mg(1.21mmol)叔丁醇钠，氮气保护，100℃搅拌反应12小时。反应完全后体系降温至室温，倒入150mL冰水中淬灭，50mL DCM萃取三次，合并有机相，后用50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得浅黄色固体52mg，收率44％。

[0441] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.09(s,1H),8.35(d,J＝2.2Hz,1H),8.21(d,J＝2.3Hz,1H),8.00(d,J＝8.2Hz,1H),7.55–7.45(m,2H),7.31–7.20(m,1H),7.16(t,J＝8.0Hz,1H),6.53(dd,J＝8.9,1.0Hz,1H),6.49–6.40(m,1H),3.77(s,3H).

[0440]

LC-MS：290(M+1)。

[0443] 实施例26 N-(3-甲氧基苯基)-N-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-胺(化合

[0442]

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说明书

35/47页

物Ⅰ-27)的制备

[0444]

100mg(0.404mmol)化合物5，73mg(0.526mmol)化合物6b为原料，参考化合物Ⅰ-26制备方法得黄色固体55mg，收率45％。

[0446] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ10.16(s,1H),8.51(s,1H),8.45–8.30(m,2H),8.20(s,1H),8.04(dd,J＝22.8,9.8Hz,1H),7.61–7.39(m,3H),7.23–7.03(m,1H),6.45–6.27(m,2H),3.74(s,3H),3.41(s,3H).[0447] LC-MS：304(M+1)。

[0448] 实施例27 3-((3-甲氧基苯基)-硫代)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(化合物Ⅰ-28)的制备

[0445] [0449]

100mg(0.404mmol)化合物5，85mg(0.606mmol)化合物6c为原料，参考化合物

Ⅰ-26制备方法得黄色固体55mg，收率44％。

[0451] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.53(s,1H),8.63(d,J＝2.1Hz,1H),8.50(d,J＝2.1Hz,1H),8.03(d,J＝7.8Hz,1H),7.54–7.50(m,2H),7.34–7.27(m,1H),7.16(t,J＝7.9Hz,1H),6.78–6.67(m,3H),3.72(s,3H).[0452] LC-MS：307(M+1)。

[0453] 实施例28 3-((3-甲氧基苯基)-亚砜基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(化合物Ⅰ-29)的制备

[0450] [0454]

于25mL圆底烧瓶中，加入20mg(0.065mmol)化合物Ⅰ-28，11mg(0.07mmol)mCPBA，

5mL DCM，室温搅拌反应3小时，后倒入150mL DCM中，依次用50mL饱和硫代硫酸钠溶液，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(石油醚/

[0455]

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说明书

36/47页

乙酸乙酯＝3:1)得浅黄色固体19mg，收率90％。

[0456] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.24(s,1H),8.86(s,1H),8.73(s,1H),8.28(d,J＝9.0Hz,1H),7.69(d,J＝11.9Hz,1H),7.52(s,2H),7.50–7.33(m,1H),7.29(m,2H),7.04(d,J＝8.2Hz,1H),3.80(s,3H).[0457] LC-MS：323(M+1)。

[0458] 实施例29 3-((3-甲氧基苯基)-砜基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚(化合物Ⅰ-30)的制备

[0459]

20mg(0.065mmol)化合物Ⅰ-28，22mg(0.14mmol)mCPBA为原料，参考化合物Ⅰ-29

制备方法，得浅黄色固体15mg，收率68％。

[0461] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.50(s,1H),9.18(s,1H),8.98(s,1H),8.37(d,J＝9.1Hz,1H),7.65–7.47(m,5H),7.41–7.29(m,1H),7.22(d,J＝9.9Hz,1H),3.84(s,3H).[0462] LC-MS：339(M+1)。

[0463] 实施例30 (2-(甲胺基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-31)的制备

[0460] [0464]

于25mL圆底烧瓶中，加入35mg(0.122mmol)化合物Ⅰ-1，5mL吡啶，室温下滴加

42mg(0.146mmol)三氟甲磺酸酐，滴加完后室温搅拌反应过夜。次日将反应体系减压旋转蒸干，加入23mg(0.122mmol)碘化亚铜，15mL甲氨的乙醇溶液，100℃密封反应过夜。次日降温至室温后倒入150mL水中，50mL DCM萃取三次，合并有机相，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)得橘红色固体35mg，收率94％。

[0466] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.29(s,1H),8.35(s,1H),8.21(s,1H),8.08(d,J＝8.1Hz,1H),7.74(s,1H),7.61–7.49(m,3H),7.38–7.29(m,1H),7.04(d,J＝7.7Hz,1H),6.92–6.82(m,1H),6.70–6.59(m,1H),3.28(s,3H).[0467] LC-MS：302(M+1)。

[0468] 实施例31 (2-氨基-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮

[0465]

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说明书

37/47页

(化合物Ⅰ-32)的制备

[0469]

以71mg(0.222mmol)化合物Ⅰ-4为原料，参考化合物Ⅰ-31制备方法，以氨气的乙醇溶液代替甲胺的乙醇溶液氨解，得黄色固体18mg，收率26％。

[0471] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.20(s,1H),8.83(s,1H),8.68(s,1H),8.30(d,J＝8.8Hz,1H),7.59–7.47(m,2H),7.32–7.23(m,1H),7.05(dd,J＝8.3,3.0Hz,1H),6.94–6.83(m,1H),6.51(s,1H),3.58(s,3H).[0472] LC-MS：318(M+1)。

[0473] 实施例32 (2-甲氨基-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-33)的制备

[0470] [0474]

以71mg(0.222mmol)化合物Ⅰ-4为原料，参考化合物Ⅰ-31制备方法，得黄色固

体50mg，收率68％。

[0476] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.13(s,1H),8.55(s,1H),8.35(s,1H),8.21(d,J＝8.1Hz,1H),7.80–7.40(m,3H),7.26(s,1H),6.94(m,2H),6.29(s,1H),3.46(s,3H),3.21(s,3H).

[0477] LC-MS：332(M+1)。

[0478] 实施例33 (2-羟基-5-甲氧基苯基)(9-(2-(二甲氨基)乙基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-34)的制备

[0475] [0479]

[0480] 于25mL圆底烧瓶中，加入100mg(0.314mmol)化合物Ⅰ-4，5mL DMF，0℃下加入

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说明书

38/47页

50mg(1.26mmol)NaH，室温反应1小时。后加入37mg(0.345mmol)2-氯-N,N-二甲基乙胺，室温搅拌反应36小时。反应体系倒入150mL冰水中，50mL DCM萃取三次，合并有机相，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品用硅胶柱层析纯化(DCM/CH3OH＝20:1)得褐色固体58mg，收率48％。

[0481] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.75(s,1H),8.90(s,1H),8.78(s,1H),8.34(d,J＝8.4Hz,1H),7.82–7.71(m,1H),7.58(t,J＝7.6Hz,1H),7.32(t,J＝7.9Hz,1H),7.12–7.01(m,1H),7.03–6.86(m,2H),4.61(s,2H),3.72(s,3H),2.74(s,2H),2.21(s,6H).[0482] LC-MS：390(M+1)。

[0483] 实施例34 (2-羟基-5-甲氧基苯基)(9-(2-羟乙基)-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-35)的制备

[0484]

以100mg(0.314mmol)化合物Ⅰ-4，65mg(0.345mmol)2-溴乙醇为原料，参考化合

物Ⅰ-34制备方法，得白色固体60mg，收率53％。

[0486] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.74(s,1H),8.90(s,1H),8.78(s,1H),8.33(d,J＝7.9Hz,1H),7.76(d,J＝8.8Hz,1H),7.57(t,J＝7.8Hz,1H),7.32(t,J＝7.4Hz,1H),7.14–7.04(m,1H),6.99–6.89(m,2H),4.91(t,J＝5.4Hz,1H),4.57(t,J＝6.4Hz,2H),3.91–3.78(m,2H),3.73(s,3H).[0487] LC-MS：363(M+1)。

[0488] 实施例35 (5-(二甲胺基)-2-羟基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-36)的制备

[0485] [0489]

于15mL封管中，加入100mg(0.272mmol)化合物Ⅰ-7，52mg(0.272mmol)碘化亚

铜，10mL二甲氨的水溶液，120℃下密封反应过夜。冷却至室温后将反应体系倒入150mL水中，50mL DCM萃取三次，合并有机相，随后用50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(DCM/CH3OH＝20:1)得褐色固体15mg，收率17％。

[0491] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.27(s,1H),9.51(s,1H),8.88(s,1H),8.73(s,1H),8.29(d,J＝10.2Hz,1H),7.61–7.42(m,2H),7.37–7.12(m,2H),7.05–6.84(m,1H),6.82–

[0490]

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说明书

39/47页

6.58(m,1H),2.81(s,6H).[0492] LC-MS：332(M+1)。

[0493] 实施例36 (2-羟基-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮肟(化合物Ⅰ-44)的制备

[0494]

于15mL封管中，加入100mg(0.314mmol)化合物Ⅰ-4，88mg(1.26mmol)盐酸羟胺，

130mg(1.57mmol)醋酸钠，10mL乙二醇，130℃下密封反应过夜。冷却至室温后将反应体系倒入150mL水中，50mL DCM萃取三次，合并有机相，随后用50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(DCM/CH3OH＝20:1)得白固体95mg，收率90％。

[0495]

H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.00(s,1H),11.69(s,1H),10.47(s,1H),8.57(s,1H)

,8.37(s,1H),8.20(d,J＝8.2Hz,1H),7.61–7.41(m,2H),7.30–7.15(m,2H),6.89(s,1H),6.50(s,1H),3.56(s,3H).[0497] LC-MS：334(M+1)。

[0498] 实施例37 2-(羟基(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲基)-4-硝基苯酚(化合物8a)的制备

[0496] [0499]

于25mL长颈圆底两口瓶中，氮气氛围下加入200mg(0.809mmol)化合物5，15mL重

蒸THF，降温至-78℃，缓慢滴加0.9mL(1.13mmol)1.3M甲基锂THF溶液，-78℃下搅拌反应半小时，缓慢滴加1.3mL(1.64mmol)1.3M叔丁基锂THF溶液，-78℃下搅拌反应半小时，体系呈深绿色。然后，缓慢滴加774mg(3.24mmol)化合物7a的5mL THF(重蒸)溶液，滴加完全后自然缓慢升温至室温，继续反应20小时。后将反应体系倒入150mL饱和氯化铵中，50mL DCM萃取三次，合并有机相，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品硅胶柱层析纯化(DCM/CH3OH＝20:1)得褐色固体184mg，收率65％。

[0500]

LC-MS：350(M+1)。

[0502] N-(4-羟基-3-(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-羰基)苯基)乙酰胺(化合物Ⅰ-25)的制备

[0501] [0503]

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说明书

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于50mL圆底烧瓶中，加入180mg(0.516mmol)化合物8a，30mL无水DCM，241mg(0.568mmol)Dess-Martin氧化剂，室温搅拌反应3小时。后将反应体系倒入150mL DCM中，50mL水洗涤三次，有机相依次用50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，粗品加入144mg(2.58mmol)铁粉，5mL醋酸，加热回流反应2小时。后将反应体系倒入150mL水中，50mL DCM萃取三次，合并有机相,用50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干，粗品用硅胶柱层析纯化(DCM/CH3OH＝50:1)得褐色固体25mg，收率14％。

[0505] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.31(s,1H),10.12(s,1H),9.89(s,1H),8.88(s,1H),8.73(s,1H),8.29(d,J＝8.9Hz,1H),7.76–7.61(m,2H),7.61–7.45(m,2H),7.33–7.23(m,1H),6.95(d,J＝9.1Hz,1H),2.00(s,3H).[0506] LC-MS：346(M+1)。

[0507] 实施例38 (2-(二甲胺基)-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲醇(化合物8b)的制备

[0504] [0508]

以200mg(0.809mmol)化合物5，629mg(3.24mmol)化合物7b为原料，参考化合物

8a制备方法，得黄色固体202mg，收率72％。

[0510] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.60(s,1H),8.51(s,1H),8.41(s,1H),8.03(d,J＝7.7Hz,1H),7.57–7.41(m,2H),7.34–7.19(m,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),6.58(d,J＝2.9Hz,1H),6.16(s,1H),3.73(s,3H),2.62(s,6H).[0511] LC-MS：348(M+1)。

[0512] (2-(二甲胺基)-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-37)的制备

[0509] [0513]

[0514] 于50mL圆底烧瓶中，加入200mg(0.576mmol)化合物8b，30mL无水DCM，

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269mg(0.634mmol)Dess-Martin氧化剂，室温搅拌反应3小时。然后将反应体系倒入150mL DCM中，50mL水洗涤三次后，有机相用50mL饱和碳酸氢钠洗涤，50mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪蒸干溶剂，粗品用硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得红褐色固体155mg，收率78％。

[0515] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.27(s,1H),8.86(s,1H),8.64(s,1H),8.29(d,J＝8.3Hz,1H),7.64–7.45(m,2H),7.31–7.06(m,3H),6.94–6.86(m,1H),3.76(s,3H),2.49(s,6H).

[0516] LC-MS：346(M+1)。

[0517] 实施例39 (2-2-(二甲胺基)乙氧基)-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲醇(化合物Ⅰ-38)的制备

[0518]

以200mg(0.809mmol)化合物5，723mg(3.24mmol)化合物7c为原料，参考化合物

8a制备方法，得浅黄色固体150mg，收率47％。

[0520] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.66(s,1H),8.43–8.35(m,2H),8.12(d,J＝7.7Hz,1H),7.51–7.36(m,2H),7.26–7.13(m,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),6.79–6.71(m,1H),6.09(s,1H),4.03–3.84(m,2H),3.73(s,3H),2.64–2.53(m,2H),2.18(s,6H).[0521] LC-MS：392(M+1)。

[0522] 实施例40 2-(2-(二甲胺基)乙氧基)-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-40)的制备

[0519] [0523]

以100mg(0.255mmol)化合物Ⅰ-38为原料，参考化合物化合物Ⅰ-37制备方法得

白色固体52mg，收率52％。

[0525] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H),8.85(s,1H),8.67(s,1H),8.30(d,J＝8.9Hz,1H),7.93(d,J＝10.8Hz,1H),7.58–7.41(m,2H),7.32–7.10(m,2H),7.00(s,1H),4.09–3.93(m,2H),3.77(s,3H),2.39–2.23(m,2H),1.92(s,6H).

[0524]

CN 105820165 A[0526]

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LC-MS：390(M+1)。

[0527] 实施例41 2-((2-(羟基(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲基)-4-甲氧基苯氧基)乙醇(化合物Ⅰ-39)的制备

[0528]

以150mg(0.607mmol)化合物5，652mg(2.43mmol)化合物7d为原料，参考化合物

8a制备方法，得浅黄色固体133mg，收率60％。

[0530] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.64(s,1H),8.46(s,1H),8.44(s,1H),8.13(d,J＝7.6Hz,1H),7.48–7.36(m,1H),7.25(d,J＝3.2Hz,1H),7.21–7.14(m,1H),6.83(d,J＝9.1Hz,1H),6.73(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H),6.17(d,J＝4.0Hz,1H),5.84(d,J＝4.0Hz,1H),4.92(t,J＝5.3Hz,1H),3.96–3.78(m,2H),3.72(s,3H),3.71–3.65(m,2H).[0531] LC-MS：365(M+1)。

[0532] 实施例42 (2-(2-羟基乙氧基)-5-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-41)的制备

[0529] [0533]

以95mg(0.261mmol)化合物Ⅰ-39为原料，参考化合物化合物Ⅰ-37制备方法得

白色固体72mg，收率77％。

[0535] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.30(s,1H),8.87(s,1H),8.68(s,1H),8.30(d,J＝8.1Hz,1H),7.61–7.44(m,2H),7.35–7.07(m,3H),6.97(s,1H),4.54(t,J＝5.4Hz,1H),3.91(t,J＝5.4Hz,2H),3.77(s,3H),3.31–3.20(m,2H).[0536] LC-MS：363(M+1)。

[0537] 实施例43 2-(羟基(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲基)-4-甲氧基苯酚(化合物Ⅰ-42)的制备

[0534] [0538]

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以150mg(0.607mmol)化合物5，544mg(2.43mmol)化合物7e为原料，参考化合物8a制备方法，得白色固体113mg，收率58％。

[0540] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.70(s,1H),9.02(s,1H),8.40(s,2H),8.14(d,J＝7.7Hz,1H),7.51–7.37(m,2H),7.24–7.11(m,2H),6.72–6.59(m,2H),6.11(d,J＝4.0Hz,1H),5.87(d,J＝4.2Hz,1H),3.69(s,3H).[0541] LC-MS：321(M+1)。

[0542] 实施例44 (3-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲醇(化合物8c)的制备

[0539] [0543]

以200mg(0.809mmol)化合物5，441mg(3.24mmol)化合物7f为原料，参考化合物

8a制备方法，得白色固体200mg，收率81％。

[0545] H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ9.06(s,1H),8.48(s,1H),8.33(s,1H),8.02(d,J＝8.4Hz,1H),7.52–7.43(m,2H),7.34–7.28(m,2H),7.07–7.00(m,2H),6.84(dd,J＝8.7,3.1Hz,1H),6.07(s,1H),3.81(s,3H).[0546] LC-MS：305(M+1)。

[0547] (3-甲氧基苯基)(9H-吡啶并[2,3-b]吲哚-3-取代)甲酮(化合物Ⅰ-43)的制备

[0544] [0548]

以200mg(0.658mmol)化合物8c为原料，参考化合物化合物Ⅰ-37制备方法得白

色固体112mg，收率56％。

[0550] H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.34(s,1H),8.94(s,1H),8.79(s,1H),8.32(d,J＝7.8Hz,1H),7.66–7.47(m,3H),7.42–7.16(m,4H),3.84(s,3H).[0551] LC-MS：303(M+1)。[0552] 生物活性测试实验[0553] 1、部分化合物对肿瘤细胞生长抑制实验

[0549]

CN 105820165 A[0554]

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实验方法：磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法(参考文献：Zhang Z,Meng T,Yang N,Wang W,Xiong B,Chen Y,et al.MT119,a new planar-structured compound,targets the colchicine site of tubulin arresting mitosis and inhibiting tumor cell proliferation.International Journal of Cancer 2011；129(1):214-24)

[0555] 具体方法如下：

[0556] (1)将处于对数生长期的细胞按照合适密度接种于96孔培养板，每孔90μl，培养过夜；

[0557] (2)加入不同浓度的化合物作用72h，每个浓度3个复孔，并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔；[0558] (3)作用结束后，贴壁细胞倾去培养液，加入10％(w/v)三氯乙酸(100μl/孔)于4℃固定1h；

[0559] (4)用蒸馏水冲洗5次，在室温下干燥后，每孔加入SRB溶液(4mg/ml，溶于1％冰乙酸)100μl，室温下孵育染色15min；

[0560] (5)用1％冰乙酸冲洗5次以洗去未结合的SRB，室温干燥后，每孔加入150μl 10mM Tris溶液，酶标仪测定560nm波长下的光密度(OD值)。[0561] 按照以下公式计算化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用：抑制率(％)＝(OD对照孔-OD

并据此按logit法计算达到50％抑制率时的化合物浓度，即IC50值。给药孔)/OD对照孔×100％，

实验重复3次，计算平均值及标准差。[0562] 实验结果显示，不少化合物对HeLa细胞及HT-29(American Type Culture Collection)细胞均具有良好的抑制活性(表1.)。其中化合物Ⅰ-4对多种肿瘤细胞口腔癌，肺癌，肝癌，白血病，胃癌，宫颈癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠癌和前列腺癌细胞具有较强的抑制作用，抗瘤谱较广(图1)。

[0563] 表1.部分化合物在细胞水平对HeLa和HT-29细胞的增殖生长抑制作用

[0564]

[0565]

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2、化合物Ⅰ-4对细胞微管蛋白的影响

[0567] 实验方法：免疫荧光法(Immunofluorescence-based laser confocal microscopy)(参考文献Wang W,Wang YQ,Meng T,Yi JM,Huan XJ,Ma LP,et al.MCL-1Degradation Mediated by JNK Activation via MEKK1/TAK1-MKK4Contributes to Anticancer Activity of New Tubulin Inhibitor MT189.Molecular Cancer Therapeutics,2014；13(6):1480-91)。其原理是抗原抗体的特异性结合反应。[0568] 具体方法如下：

[0569] (1)将对数生长期HeLa细胞(American Type Culture Collection)(1×10个/孔)接种于12孔培养板的盖玻片上；[0570] (2)细胞贴壁过夜后，加入不同浓度的化合物Ⅰ-4及阳性对照化合物紫杉醇(paclitaxel)和长春新碱(vincristine)(Sigma-Aldrich)，处理HeLa细胞1h；[0571] (3)将培养液弃掉，每孔加入1ml 4％多聚甲醛，固定30min；[0572] (4)用含0.2％的Tween-20的TBST洗液洗涤3次，每孔加入1ml 0.2％Triton X-100通透细胞15min；

[0573] (5)用TBST洗液洗涤3次，每孔加入1ml 3％BSA封闭15min；[0574] (6)小心夹取盖玻片，细胞面朝下置于Parafilm膜上3％BSA配制的一抗溶液中，于湿润条件下杂交1h；

[0575] (7)用TBST洗液洗涤3次，小心夹取盖玻片，细胞面朝下置于Parafilm膜上3％BSA配制的二抗溶液中，于湿润条件下杂交1h；[0576] (8)用TBST洗液洗涤3次，向载玻片上滴加含DAPI的封片剂3μl，夹取盖玻片细胞面朝下放在载玻片上，利用共聚焦荧光显微镜观察微管状态的变化情况并拍照。[0577] 实验结果显示，化合物Ⅰ-4与微管解聚剂相同，促进微管发生解聚，而与微管稳定剂紫杉醇作用不同(图2)。在0.1μM时化合物Ⅰ-4就能明显使微管发生解聚，破坏其细胞内正常的网络状分布；0.3μM时几乎能使微管完全解聚。[0578] 3、化合物Ⅰ-4对拓扑异构酶II(Top2)的影响[0579] 实验方法：Top2介导的kDNA去连环反应(Top2-mediated supercoiled pBR322relaxation)(参考文献：Meng LH,Zhang JS,Ding J.Salvicine,a novel DNA topoisomerase II inhibitor,exerting its effects by trapping enzyme-DNA cleavage complexes.Biochemical Pharmacology 2001；62(6):733-41)。其原理是kDNA结构呈网

[0566]

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络状，分子量很大无法进入1％的琼脂糖凝胶中，而Top2能够催化其发生去连环反应，产生2.5KB的单体环状DNA，能够快速进入1％的琼脂糖凝胶中，通过考查化合物对单体环状DNA产生的影响反映其对Top2活性的影响。[0580] 具体方法如下：[0581] 反应体系：

[0582] 100ng kDNA(TopoGEN)[0583] 4U Top2

[0584] buffer:4μl 10×DNA Top2buffer(mixed by buffer A and B in the Top2assay kit,

[0585] TopoGEN)

[0586] ddH2O:up to 20μl[0587] 反应条件：37℃；30min。

[0588] 以R16(5-(2-(dimethylamino)ethyl)-4H-benzo[de]benzo[4,5]thieno[2,3-g]isoquinoline-4,6(5H)-dione)为阳性对照，化合物Ⅰ-4分别取100μM和150μM两个浓度进行活性检测。反应结束后用1％的琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中电泳1h，电压100V。用1μg/ml的GelRed染色后通过凝胶成像系统拍照。[0589] 结果显示，100μM浓度时化合物Ⅰ-4能显著抑制Top2的kDNA解螺旋活性，Top2产生的单体环状DNA完全消失(图3)。

[0590] 4.化合物Ⅰ-4诱导肿瘤细胞凋亡与依托泊苷(Top2抑制剂)与长春新碱(微管蛋白抑制剂)联合用药区别实验[0591] 实验方法：Western blot实验(参考文献Wang W,Wang YQ,Meng T,Yi JM,Huan XJ,Ma LP,et al.Molecular Cancer Therapeutics 2014；13(6):1480-91.)[0592] 具体方法如下：

[0593] (1)将处于对数生长期的HeLa细胞，按合适密度接种于6孔培养板中，待细胞贴壁过夜后加入相应浓度的化合物，于37℃作用相应时间。[0594] (2)之后，每孔加入1×SDS上样缓冲液(50mM Tris pH 6.8，100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)裂解细胞。[0595] (3)收集细胞裂解液后，于沸水浴中加热10min，10,000rpm离心10min。取上清液进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用半干电转移系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。[0596] (4)转移结束后，用丽春红(Ponceau S)染色确定转移情况和蛋白条带在硝酸纤维素膜上的位置，标记后用含5％脱脂奶粉的封闭液[5％脱脂奶粉、20mM Tris-HCl pH7.2-7.4，150mM NaCl，0.1％Tween-20]于摇床室温封闭30min。然后，将膜置于封闭液(5％脱脂奶粉)稀释的一抗中4℃过夜。

[0597] 用洗液[100mM Tris-HCl pH7.2-7.4，0.9％NaCl，0.2％Tween-20]室温洗涤三次，每次10min。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温置于摇床上平缓摇动1h。再用洗液洗涤三次后，发色，曝光，显影，定影，拍照。根据实验需要，采用Adobe Photoshop CS2对Western blot结果进行定量分析。

实验结果表明，在诱导凋亡实验中，与浓度和时间相关，化合物Ⅰ-4诱导

肿瘤细胞凋亡机制与长春新碱类似，但不同于依托泊苷，也不同于两者的联合用

[0598]

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药。两者的联合用药不能像化合物Ⅰ-4一样抑制HeLa细胞中MCL-1(myeloid cell leukemia-1),cIAP1(cellular inhibitor of apoptosis protein-1)和XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)的表达。实验显示出化合物Ⅰ-4在诱导肿瘤细胞凋亡机制上与联合用药的区别(图4)。

[0599] 5.化合物Ⅰ-4对耐药肿瘤细胞生长抑制作用实验[0600] 实验方法及具体操作参考实验1，耐药细胞株分别为长春新碱耐药的KB细胞(KB/VCR)，对阿霉素耐药的MES-SA细胞(MES-SA/DX5)和对米托蒽醌耐药的HL60细胞(HL60/MX2)。化合物Ⅰ-4对耐药肿瘤细胞和亲代肿瘤细胞生长抑制作用见表2。

[0601] 表2.化合物Ⅰ-4在细胞水平对耐药肿瘤细胞和亲代肿瘤增殖生长抑制作用

[0602]

RF：耐药指数

[0604] 从以上结果可以看出，该类化合物具有明显的抗肿瘤作用，而且对耐药肿瘤细胞也有很强的作用，尤其是该类化合物对耐药肿瘤细胞株强烈的杀灭作用值得关注。且初步的作用机制显示该类化合物与联合用药的结果并不完全相同，如依托泊苷VP-16(Top2抑制剂)与长春新碱(微管蛋白抑制剂)的联合用药。这类双重抑制剂使将来的用药更为简便，且不易产生耐药性。

[0605] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0603]

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图1

图2

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图4

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α-咔啉类化合物,其制备方法以及用途[发明专利]