原发性肝癌中HBV X, S, Pre—S, C 基因片段整合与ras, myc 癌基因表达的关系

，６　—　１　第３６卷第１期　山东医科大学学报　Ｖｏ１．３６Ｎｏ．１　１９９８年３月　ＡＣＴＡ　ＡＣＡＤＥＭＩＡＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＡＥ　ＳＨＡＮＤＯＮＧ　Ｍａｒ．　１９９８　原发性肝癌中ＨＢＶ　Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ—Ｓ、Ｃ基因　片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系　张利宁刘素侠　孙汶生曹英林　瓤闰世坤　李华芬　７　‘　２　（山东医科大学微生物学教研室）　内容提要　用地高辛标记的ＨＢＶ基因组探针特测７　６６例肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）中　ＨＢＶ的存在状态。从中筛选出３２例权有ＨＢＶＤＮＡ整台的ＨＣＣ作为研完对象，进一步特　１　７　ＨＢＶＸ基因、Ｓ基因、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因ＤＮＡ片般的整合情况，并探讨７　ＨＢＶ　４种基因　亚片段整合与ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因表达的关系。结果显示。ＨＢＶ　Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ和Ｃ基因片段的　整合半分别为８７．５　（２８／３２）、６２．５　（２０／３２）、６２．５　（２０／３２）和２５．０　（８／３２）。ｐ２１　、　ｐ６２　在ＨＣＣ中的表达率分别为５　Ｏ　（２０／４０）、８１．２　Ａ（２６／３２）ｏ　通过对ＨＣＣ中４种　ＨＢＶ基因片段整合与ｐ２ｌ　、ｐ６２一表达之间关系的研完一显示ｐ６２　的表达与啊ＢＶ　Ｘ、　Ｐｒｅ－Ｓ基因整合关系密切，ｐ２１ＴＭ的表达则主要与ＨＢＶＸ基因整合有关（Ｐ＜０．０５）。提示　ＨＢＶ　Ｘ、Ｐｒｅ－ＳＤＮＡ片段在宿主细胞染色体上的整合可能直接或通过其蛋白启动ｍｙｃ和　（或）ｒａｓ癌基目的表达。　关键调　１９８０年Ｂｒｅｃｈｏｔ“　等发现ＨＢＶ　ＤＮＡ　自山东千佛山医院及山东省立医院。取部分新鲜　与肝癌细胞染色体整合以来，大量事实证　肝癌组织一２Ｏ℃速冻以抽提ＤＮＡ，部分用福尔马　明这种整合与肝细胞癌变密切相关，但　林固定。石蜡包埋，制备５　ｍ厚的切片。　ＨＢＶ　ＤＮＡ与肝细胞染色体整合后引起肝　１．１－２试荆鼠抗人ｍｙｅ蛋白（ｐ６２　）的单克　癌的确切机理尚不清楚。我们用地高辛标　隆抗体、鼠抗人ｒａｓ蛋白（ｐ２１ＴＭ）的单克隆抗体、限　制性校醴内切酶ＥｃｏＲ　Ｉ、ＢｇＩ　Ｉ等及蛋白酶Ｋ　记的ＨＢＶ　ＤＮＡ探针分析了６６倒ＨＣＣ中　均购自华美生物工程公司。地高辛标记试剂盒购　ＨＢＶ　ＤＮＡ的存在状态，研究了其中３２倒　自蔼国宝灵曼公司ＩｐＢＲ３２２－２ＨＢＶ重组质粒由　仅有ＨＢＶＤＮＡ整合的ＨＣＣ标本中ＨＢＶ　中国预防医学科学院病毒所惠赠，本室克隆、扩　Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ及ｃ基困片段的整合情况，井　增Ｉ曼体苗ＪＭ１０９为本室保存菌种．　比较了各基因整合与ｒ　、ｍｙｃ基因表达的　１．２方法　关系，以冀为揭示ＨＢＶ的致癌机理提供　１．２，１　探针制备按地高辛甙元标记检测试荆　依据。　盒的要求，用毽机寻Ｊ物法制备地高辛标记的Ｉ－ＩＢＶ　１材料和方法　基因组探针和ＨＢＶ　Ｘ、Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因探针，探　１．１材料　针灵敏度高于１．０ｐｇ　。　１．１．１标本经病理确诊的Ｈｃｃ标本６６倒一取　１・２－２　Ｓｏａｔｈｅｒｎ杂交从肝癌组织中抽提细胞　・山丰省科委资助嘎目　张利宁，等．原发性肝癌中Ｉ－ＩＢＶ　ｘ、ｓ、Ｐｒｏｓ、ｃ基因片段整台与ｒａ　ｍｙｃ癌基因表达的关系　ＤＮＡ．用限制性内切酶ＥｍＲ　１、Ｈｉｎｄ　Ｉ消化．　３７　明显（图１），ＨＣＣ中ｐ２１　的阳性率为　５０．Ｏ　（２Ｏ／４Ｏ）。ｐ６２　棕黄色阳性颗粒主　要存在千核，部分胞浆着色（图２），阳性率　为８１．２　（２６／３２）。　０．７艋骧脂糖凝肢电诛，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印到硝酸纤维　素膜上，然后用ＨＢＶ基因组探针杂交０　。　１．２．３纯整合型ＨＣＣ中ＨＢＶ　４种基因片段的　检测将３２倒纯整合型的ＨＣＣ细胞ＤＮＡ分别　点在硝酸纤维索膜上，按常规用ＨＢＶ　Ｘ、Ｓ、Ｐｒｙ－　Ｓ、Ｃ基因探针进行杂交。　１．２．４免疫组织化学染色（ＡＢＣ法）｝　０ｃ组　织石蜡切片．常规脱蜡、水化后．用３　Ｈ　Ｏ　去内　源性过氧化物酶－微波炉修复抗原２扶．每砍　３ｒａｉｎ，用正常马血清封闭切片３０ｒａｉｎ．加入ｐ２１Ⅲ　单抗、ｐ６２￣，　单抗，３７℃３０ｍｌｎ后４℃过夜，ＰＢＳ洗　涤后依次加入马抗鼠ＩｇＧ、ＡＢＣ复合物各６０ｒａｉｎ．　ＤＡＢ显色．苏木索复染后，常规脱水　透明，显擞　境观察。光境下细胞染成棕黄色为阳性。　图１　ｐ２１“‘在Ｈｃｃ中的表达　一　２结果　棕黄色阳性颗粒主要存在于细胞蒙内　２．１　ＨＢＶＤＮＡ在ＨＣＣ中的存在状态　Ｆｉｇ．１　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ口２ｌ　ｉｎ　ＨＣＣ　６６例ＨＣＣ标本中ＨＢＶ的检出率为　７５．８　（５０／６６），其中６４．０　（３２／５０）为纯　整合型，３６．Ｏ　（１８／５０）为混合型，无单纯　游离型。　２．２纯整合型ＨＣＣ中ＨＢＶ　４种基因片　段的检测结果杂交结果显示ＨＢＶ　Ｘ、Ｓ、　Ｐｒｅ—Ｓ、Ｃ基因的整合率分别为８７．５　（２８／　３２）、６２．５　（２０／３２）、６２．５　（２０／３２）和　２５－Ｏ　（８／３２），其中ＨＢＶ　Ｘ基因的整合　图２　ｐ６２　在ＨＣＣ中的表达　率明显高于ＨＢＶ　Ｓ基因（尸＜０．０５）、ＨＢＶ　一　在细胞蒙和细胞核内均可见棕黄色阳性颗　Ｐｒｅ－Ｓ基因（Ｐ＜０．０５）、ＨＢＶ　Ｃ基因（Ｐ＜　粒　０．０１）。　Ｆｉｇ．２　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆｐ６２　ｉｎ　ＨＣＣ　２－３　ＨＣＣ中ｐ２ｌ　、ｐ６２　蛋白表达情况　２－４　ＨＢＶ　４种基因在ＨＣＣ中整合与　ｐ２１＂￣阳性颗粒位千细胞浆内．细胞膜最　ｐ２１＂￣、ｐ６２　表达的关系见表１。　表ｌ　ＨＢＶ　４种基因片段整合与ｐ２１瑚、ｐ６２　表选的关系（　）　‘Ｐ＜Ｏ．０５　ｖ３阴性　山东医科大学学报　３６卷１期　３讨论　前尚无定论，有的学者认为，ＨＢＶ　ＤＮＡ整　ＨＢＶ　ＤＮＡ在染色体上的整合为随机　合后通过微活癌基因导致细胞癌变“　。我　的片段性整合，常伴有病毒基因的缺失，为　们在研究ＨＢＶ各基因整合情况的基础　了准确反映各ＨＢＶ基因在细胞染色体上　上，进一步研究了各ＨＢＶ基因整合与ｒａｓ、　的整合情况，我们先用ＨＢＶ基因组探针　ｍｙｃ癌基因表达的关系，结果表明，ｍｙｃ癌　从６６例ＨＣＣ中筛选出３２例仅有ＨＢＶ　基因蛋白的表达与ＨＢＶ　Ｘ、Ｐｒｅ—Ｓ基因的　ＤＮＡ整合的标本，然后用４种Ｉ－ＩＢＶ基因　整合关系密切．ｒａｓ癌基因蛋白的表达主要　片段探针检测各基因的整合情况，发现各　与ＨＢＶ　Ｘ基因整合有关，说明ＨＢＶ　Ｘ、　基因的整合率不尽相同，其中ＨＢＶ　Ｘ基　Ｐｒｅ—Ｓ基因整合在细胞染色体后，可直接　因的整合率明显高于ＨＢＶ　Ｓ、Ｉ－ＩＢＶ　Ｐｒｅ—Ｓ　或间接通过其蛋白质引起ｒａｓ、ｍｙｃ癌基因　和Ｉ－ＩＢＶＣ基因。提示ＨＢＶ　Ｘ基因整合在　的活化，表达更多的癌基因蛋白，导致细胞　ＨＣＣ发生中起更重要作用。　癌变。　ＨＢＶ　ＤＮＡ整合后引起肝癌的机理目　（收稿日期１９９６—０９—１９）　参考文献　１．１￣ｒｅｃｈｏｔ　Ｃ．Ｐｒｅｓｅｎｉｌｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｈｅｐｅｔｉｔｌｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ＤＮＡ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｄ￣ｒ　ｃａｒｄｎ￣ｍ、Ｎａｔｕｒｅ。１９８０，２８６（３１）Ｅ５３３　２、一岩娜，孙寝生．宋静，等、地膏辛甙元标记ＨＢＶ－ＤＮＡ探针的制备．山东医科大学学报，１９９３；３１（４）２１　２７９　３．孙波生，瞅利宁，■英林，等．ＨＢＶ　ＤＮＡ基因型与肝纲肫肝癌的镬测性相关研究．山东医科大学学报．　１９９５；８３（３）：１虬　４・Ｋｉｍ　ＣＭ－ｅｔ　、ＨＢ＊ｇｎｍｅ　０ｆ　ｈｅｐｅｔｌｔｌｓ　Ｂ　ｖｌｍｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｌｉｖｅｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｎ　ｔｒａｎｓａｅｉｎｃ　ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９１ｌ３５１：　３１７　５・Ｈｓｕ　ＴＹ，ｅｔ　ａｌ、Ａｃｔｉｖａｔｋｍ　ｏｆ　Ｃ－ｍｙｃ　ｂｙ　ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ　ｈｅｐａｔｋｉｓ　ｉｎｓｅｒＵｃ￣ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｅ￣ｒｃｉｎｏｍａ．　Ｃａｌ１．１９８８｝５５≈６２７　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＧＲＡＴ１０Ｎ　ＲＡＴＥ　０Ｆ　ＨＢＶ　Ｘ，Ｓ，Ｐｒｅ—Ｓ，　Ｃ　ＧＥＮＥＳ　ＩＮ　ＰＲｌＭＡＲＹ　ＨＥＰＡＴ０ＣＥＬＬＵＬＡＲ　ＣＡＲＣＩＮ０一　ＭＡ　ＡＮＤ　ＲＥＬＡＴ１０Ｎ　Ｔ０　ＴＨＥ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＱＦ　ＲＡＳ　ＡＮＤ　ＭＹＣ　０ＮＣｏＧＥＮＥＳ　Ｚｈａｎｇ　Ｌｉｎｉｎｇ，Ｌｉｕ　Ｓｕｘｌａ，Ｓｕｎ　Ｗｅｎｓｈｅｎｇ　Ｉ　ｅｔ　ａｌ　（Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｅｘｉｓｔｉｎｇ　ＳｔａｔＵＳ　ｏｆ　Ｉ－ＩＢＶ　ｉｎ　６６　ｃａｓｅｓ　ＨＣＣ　ＷａＳ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ　ｌａｂｅｌｌｅｄ　ＨＢＶ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅ．Ｔｈｅ　３２　ＣａＳｅＳ，ｗｉｔｈ　ｏｎｌｙ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＨＢＶ　ＤＮＡ，ｗｅｒｅ　ｓｅ】ｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ　ｔＯ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｉ－ＩＢＶ　Ｘ，ＨＢＶ　Ｓ，ＨＢＶ　Ｐｒｅ—Ｓ　ａｎｄ　ＨＢＶ　Ｃ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　张利宁，等．原发性肝癌中ＨＢＶ　Ｘ，Ｓ、Ｐｒｅ－Ｓ、Ｃ基因片段整合与ｒａｓ、ｒｎｙｃ癌基因表选曲关系　３９　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｓ　ａｎｄ　ｍｙｃ　ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＨＢＶ　Ｘ，ＨＢＶ　Ｓ，ＨＢＶ　Ｐｒｅ－Ｓ　ａｎｄ　ＨＢＶ　Ｃ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　８７．５　（２８／３２），６２．５　（２０／３２），６２－５　（２０／３２），２５　（８／３２）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ＨＢＶ　Ｘ　ｇｅｘｌｅ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ＨＢＶ　ｇｅｎｅｓ（Ｐ＜￣Ｏ．０５）．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｐ２１　ａｎｄ　ｐ６　ｉｎ　ＨＣＣ　ｗｅｒｅ　５０　（２０／４０），８１．２５　（２６／３２）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎ　ｒａｔｅ　ｏｆＨＢＶｆｏｕｒ　ｇｅｎｅｓｏ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ　ｏｆｏ　ｐ２１ｍ　ａｎｄ　ｐ右　ｓｈｂｗｅｄｔｈｅｒｅｗａｓ　ａ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ｏｆ　ＨＢＶ　Ｘ　ａｎｄ　ＨＢＶ　Ｐｒｅ－Ｓ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ａｌｓｏ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｇｒｅｔｉｏｎ￣ｏｆ　ＨＢＶ　Ｘ　ｇｅｎｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔｉｎｔｈｅ　ｏｔｈｅｒｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｅｉｈｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆＨＢＶＸ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｐｒｅ－Ｓ　ｇｅ￣ｌｅ　ｗｉｔｈ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｍａｙ　ａｆｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃ　ａｎｄ　ｒａｓ　ｏｎｃｏ￣ｅｓ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ　Ｌｉｖｅｒ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ；Ｏｎａｏｇｅｎｅｓ；Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｍａｒｉｅ－Ｓａｉｎｔｏｎ综合征ｌ例　山东省蘩阴县人民医院儿科马糠井刘地姜　女，６岁．生后即发现颅骨小，前后囟极大，颅麓宽。第１腑第１产，母孕期健康．体格检查；发育臂养正　常，精神可．头瞳３５ｃｍ，前囟８ｃｍ×９＇Ｓｅｒｅ，后囟７ｃｍ，右冠状麓４ｅｒａ，矢状肇５ｃｍ，右面骨４￣ｘｎ￣４ｃｍ，左面骨　５ｃｍ×Ｓｅｒｅ，左囊骨缺如．血钙、钾，毒内、氯正常，颅脑Ｂ超示脑室正常，无扩大。ｘ片示颅顶谙骨发育极小，　左囊骨缺如．服小儿鱼肝油及钙荆治疗．３．５十月时头目４０ｃｍ，前囟９ｃｍ×９锄，后囟６　ｍ，矢状缝７ｃｍ，人　字麓５ｃｍ，右顶骨６锄×６ｃｍ．左顶骨５ｃｍ×５ｃｍ，囊骨仍缺如．６岁时因问戢性头痛１年复诊。头围５１．５ｃｍ，　身高９５ｃｍ，精神良好，智力正常。短头畸形．矢状麓未闭，前囟部位宽３ｃｍ，面部宽１．　ｍ，长ｔｌｃｍ，喀凹　陷，张力不高。面臂小而发育不全，双肩内收程度较常人明星增大．脊柱前凸．心肺废正常，神经反射正　常．曹电图示双面、枕区散发及短程ｌ５ｏ～２００ｍＹ尖渡，问有０渡，过度换气时尖波明星增多．ｘ线检查　示，头颅横径较大，前囟未闭合，问豫达３ｃｍ，有肇闻骨，左越骨中段束发育，内外形成假关节，右馈骨中内　段未发育．上胡赛腔精小。诊断：Ｍａｒｉｅ—ｓ出Ｉｔ∞综合征。　：　其父３８岁．矢收麓明星凹陷，但各颅骨完垒融合，面窖、体型同患儿，牙齿只捌切牙、村切牙及第一磨　牙．中切牙是３７岁时重新萌出，但生长迟埋．两馈骨中段未发育．父系母系其他成员未见异常．　讨论Ｍｓ￣＆－－Ｓａｉｎｕｍ综合征又名Ｈ．１ｋｅｒａｎｔ骨形成不垒，Ｓｅ．ｈｅｓ￣ｍｒ综合征，馈骨颅骨发育不　全综合征。车病征为原发性受染骨的骨化性疾病，为常染色体显性遣传，亦有自发病倒．颅骨、手、骨盐可　有埋慢骨化趋势－锁骨不同程度的发育不全，使肩部有不正常的活动。发育不全的馈　压追可致神经系　巍和心血管系统症状。头部发育异常（短头畸形），儿童及成人朔仍存留有颇骨缝囟门不完全闭合。面臂　小且发育欠佳．乳爽气室缺如或较小，限距宽・常呈徕儒状，脊柱后凸、佣凸或前凸，脊柱裂，可有病理性　骨折．亦有报道伴囊痛、精神分裂盎、精神迟＃Ｉ者。　（收稿日期１９９７－０１．１５）