一种提高记忆力的多肽及制成的保健品[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108949884 A(43)申请公布日 2018.12.07

(21)申请号 201810904595.1(22)申请日 2018.08.09

(71)申请人 姚峰

地址 215168 江苏省苏州市吴中经济开发

区澄湖东路10号(72)发明人 姚峰　(51)Int.Cl.

C12P 21/06(2006.01)C07K 2/00(2006.01)C07K 1/36(2006.01)C07K 1/34(2006.01)C07K 1/18(2006.01)A61K 38/01(2006.01)A61P 25/00(2006.01)A23L 33/18(2016.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图2页

(54)发明名称

一种提高记忆力的多肽及制成的保健品(57)摘要

本发明公开了一种提高记忆力的多肽及制成的保健品。本发明实验结果表明，不同剂量的PP1、PP3、PP7可以有效提高上述记忆相关基因的表达水平，而PP5不具备这样的活性。因此，本发明方法制备得到的多肽PP1、PP3、PP7可以用于支撑提高记忆力的保健品。比如，将其与常规的保健品辅料混合后直接装胶囊或制成颗粒后再装胶囊，或者制成乳剂、口服液等。

CN 108949884 ACN 108949884 A

权　利　要　求　书

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1.一种多肽，其特征在于，由如下步骤制备得到：步骤S1，酶解：

将羊角拗种子粉碎，过50目筛，按照1kg细粉加5L蒸馏水的比例分散于蒸馏水中，再按照细粉重量百分含量0.45％的比例加入酶活为2.4AU/g的碱性蛋白酶，酶解条件为：pH值，8.0；酶解温度，50℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，沸水浴使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，12000rpm离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥得冻干粉；

步骤S2，分离纯化：

将冻干粉用蒸馏水溶解，用截留分子量为8000～10000D的透析袋透析24h，透析液浓缩后上样于DEAE-32纤维素离子交换层析柱纯化，方法为：将DEAE-32悬浮于50mmol/L、pH值8.0Tris-HCl缓冲液中，自然沉降法装柱，平衡后备用；透析液浓缩液上样，依次用含0.1mol/L、0.3mol/LNaCl的平衡缓冲液各洗脱10个柱体积，收集0.3mol/LNaCl洗脱液，脱盐，浓缩、冷冻干燥得多肽PP3。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：步骤S2中DEAE-32纤维素离子交换层析柱的柱床体积为3×45cm。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：步骤S2中DEAE-32纤维素离子交换层析柱的上样体积为2ml。

4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：步骤S2中洗脱流速为0.8ml/min。5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，步骤S2中脱盐方法为：用截留分子量为8000～10000D的透析袋透析12h。

6.权利要求1～5任一所述多肽在制备提高记忆力的保健品方面的应用。

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CN 108949884 A

说　明　书

一种提高记忆力的多肽及制成的保健品

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技术领域

[0001]本发明涉及一种提高记忆力的保健品，该保健品可以提高记忆力。

背景技术

[0002]记忆力下降是一种病症，临床上尤以40～60岁的人最为多见，她们迫切渴望知识更新，却常常感到力不从心；一些中青年男性，由于社会压力引发心理问题，感到工作紧张、焦虑、易怒，导致记忆力下降。目前尚没有有效的药品或保健品治疗记忆力下降。发明内容

[0003]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高记忆力的多肽及制成的保健品。

[0004]本发明上述目的通过如下技术方案实现：[0005]一种多肽，由如下步骤制备得到：[0006]步骤S1，酶解：

[0007]将羊角拗种子粉碎，过50目筛，按照1kg细粉加5L蒸馏水的比例分散于蒸馏水中，再按照细粉重量百分含量0.45％的比例加入酶活为2.4AU/g的碱性蛋白酶，酶解条件为：pH值，8.0；酶解温度，50℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，沸水浴使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，12000rpm离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥得冻干粉；[0008]步骤S2，分离纯化：

[0009]将冻干粉用蒸馏水溶解，用截留分子量为8000～10000D的透析袋透析24h，透析液浓缩后上样于DEAE-32纤维素离子交换层析柱纯化，方法为：将DEAE-32悬浮于50mmol/L、pH值8.0Tris-HCl缓冲液中，自然沉降法装柱，平衡后备用；透析液浓缩液上样，依次用含0.1mol/L、0.3mol/LNaCl的平衡缓冲液各洗脱10个柱体积，收集0.3mol/LNaCl洗脱液，脱盐，浓缩、冷冻干燥得多肽PP3。[0010]优选地，步骤S2中DEAE-32纤维素离子交换层析柱的柱床体积为3×45cm。[0011]优选地，步骤S2中DEAE-32纤维素离子交换层析柱的上样体积为2ml。[0012]优选地，步骤S2中洗脱流速为0.8ml/min。[0013]优选地，步骤S2中脱盐方法为：用截留分子量为8000～10000D的透析袋透析12h。[0014]上述多肽在制备提高记忆力的保健品方面的应用。

[0015]中枢神经系统内突触联系的可塑性和复杂性构成了学习记忆的神经生理学基础，学习过程中突触联系的形成，涉及神经元膜重建过程。AKT是多种信号通路的主要参与者，不但能使凋亡蛋白磷酸化而失活，还可促进抗凋亡蛋白的生成，具有促进细胞增殖分化、抑制细胞凋亡的作用。CREB作为一种核转录因子，是记忆由短期向长期转变的限速物，在长期记忆形成中发挥重要作用。有研究发现，诱导CREB高表达可加强长期记忆。CREB可被多种信号通路磷酸化而激活，促进海马区神经元的生成和存活。Caveolin家族是胞膜窖的主要结构成分，在细胞胆固醇稳态的维持、膜泡运输和信号转导的调控等过程中发挥作用，脑内胆

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说　明　书

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固醇的合成与分布影响突触可塑性与胞膜重建。Caveolin-1和Caveolin-2是此家族的主要成员，且常常共表达，Caveolin-1的表达为Caveolin-2在膜上的表达提供准确定位。Caveolin-1与大脑发育和学习记忆的产生关系密切，不仅能召集突触传递相关信号的分子来调控膜泡运输，还能调节胆固醇的运输合成和重新分布，促进神经元膜的重新形成，从而影响学习记忆过程。

[0016]实验结果表明，不同剂量的PP1、PP3、PP7可以有效提高上述记忆相关基因的表达水平，而PP5不具备这样的活性。因此，本发明方法制备得到的多肽PP1、PP3、PP7可以用于支撑提高记忆力的保健品。比如，将其与常规的保健品辅料混合后直接装胶囊或制成颗粒后再装胶囊，或者制成乳剂、口服液等。附图说明

[0017]图1为不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对AKT基因表达的影响；[0018]图2为不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对CREB基因表达的影响；[0019]图3为不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对Caveolin-1基因表达的影响；[0020]图4为不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对Caveolin-2基因表达的影响。

具体实施方式

[0021]下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。[0022]一、实验材料

[0023]羊角拗的种子采集于海南省临高县加来镇，经鉴定为夹竹桃科羊角拗属植物羊角拗Strophanthus divaricatus(Lour.)Hook.etArn.的种子。采收后于(55±5)℃烘干备用。[0024]碱性蛋白酶(Alcalase，2.4AU/g)购于Novo公司。[0025]透析袋(8000～10000D)购自美国Sigma公司。[0026]二、实验方法[0027]1、羊角拗种子多肽的制备[0028]步骤S1，酶解：

[0029]将羊角拗种子粉碎，过50目筛，按照1kg细粉加5L蒸馏水的比例分散于蒸馏水中，再按照细粉重量百分含量0.45％的比例加入酶活为2.4AU/g的碱性蛋白酶，酶解条件为：pH值，8.0；酶解温度，50℃；酶解时间，6小时；酶解结束后，沸水浴使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，12000rpm离心15分钟，收集上清液，冷冻干燥得冻干粉；[0030]步骤S2，分离纯化：

[0031]将冻干粉用蒸馏水溶解，用截留分子量为8000～10000D的透析袋透析24h，透析液浓缩后上样于DEAE-32纤维素离子交换层析柱纯化，方法为：将DEAE-32悬浮于50mmol/L、pH值8.0 Tris-HCl缓冲液中，自然沉降法装柱，柱床体积为3×45cm，平衡后备用；透析液浓缩液上样2ml，依次用含0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L NaCl的平衡缓冲液各洗脱10个柱体积，流速为0.8ml/min，分别收集不同浓度洗脱液，用截留分子量为8000～10000D的透析袋透析12h脱盐，浓缩、冷冻干燥得多肽PP1、PP3、PP5、PP7。[0032]2、记忆力增强实验

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将54只体重为30-35g的6周龄昆明种小白鼠单笼饲养，自由饮食。每天7:00-19:00

给予光照，其余时间给予黑暗。动物房温度为23-25℃。小鼠随机分成6只/组(对照组和PP1、PP3、PP5、PP7低剂量、高剂量组)，对照组灌胃PBS，PP1、PP3、PP5、PP7低剂量组灌胃PP1、PP3、PP5、PP7的PBS溶液0.25g/kg bw，PP1、PP3、PP5、PP7高剂量组灌胃PP1、PP3、PP5、PP7的PBS溶液0.50g/kg bw，持续灌胃6周。[0034]最后一次灌胃6小时后，处死小鼠并立即用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)将小鼠脑组织总RNA提取出来后，再反转录成cDNA。各样品设3复孔，采用表1所示的引物并按如下反应程序进行qPCR：(1)预变性：95℃，3min；(2)变性：95℃，5s；(3)退火延伸：55.0℃(AKT：57.0℃；CREB：57.0℃；Caveolin-1：56.0℃；Caveolin-2：56.0℃)，30s；总共40个循环。采用2-ΔΔct法计算记忆力相关基因的mRNA相对表达量。[0035]表1记忆力相关基因的引物

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3、统计学方法

[0038]数据统计及分析采用SPSS19.0，组间分析比较采用One-wayANOVA，以均数±标准差表示；实时荧光定量PCR数据分析及绘图采用GraphPad Prism 6。p<0.05差异显著。[0039]三、实验结果[0040]不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对AKT基因表达的影响如表2和图1所示。不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对CREB基因表达的影响如表3和图2所示。不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对Caveolin-1基因表达的影响如表4和图3所示。不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对Caveolin-2基因表达的影响如表5和图4所示。[0041]表2不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对AKT基因表达的影响

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[0043][0044]

表3不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对CREB基因表达的影响

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表4不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对Caveolin-1基因表达的影响

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表5不同剂量PP1、PP3、PP5、PP7对Caveolin-2基因表达的影响

中枢神经系统内突触联系的可塑性和复杂性构成了学习记忆的神经生理学基础，

学习过程中突触联系的形成，涉及神经元膜重建过程。AKT是多种信号通路的主要参与者，不但能使凋亡蛋白磷酸化而失活，还可促进抗凋亡蛋白的生成，具有促进细胞增殖分化、抑制细胞凋亡的作用。CREB作为一种核转录因子，是记忆由短期向长期转变的限速物，在长期记忆形成中发挥重要作用。有研究发现，诱导CREB高表达可加强长期记忆。CREB可被多种信号通路磷酸化而激活，促进海马区神经元的生成和存活。Caveolin家族是胞膜窖的主要结构成分，在细胞胆固醇稳态的维持、膜泡运输和信号转导的调控等过程中发挥作用，脑内胆固醇的合成与分布影响突触可塑性与胞膜重建。Caveolin-1和Caveolin-2是此家族的主要

[0050]

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成员，且常常共表达，Caveolin-1的表达为Caveolin-2在膜上的表达提供准确定位。Caveolin-1与大脑发育和学习记忆的产生关系密切，不仅能召集突触传递相关信号的分子来调控膜泡运输，还能调节胆固醇的运输合成和重新分布，促进神经元膜的重新形成，从而影响学习记忆过程。

[0051]上述实验结果表明，不同剂量的PP1、PP3、PP7可以有效提高上述记忆相关基因的表达水平，而PP5不具备这样的活性。因此，本发明方法制备得到的多肽PP1、PP3、PP7可以用于支撑提高记忆力的保健品。比如，将其与常规的保健品辅料混合后直接装胶囊或制成颗粒后再装胶囊，或者制成乳剂、口服液等。

[0052]上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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