板蓝根多糖的毒性试验及对小白鼠免疫系统的作用研究

王宏艳;麻延峰;周文仙

【摘 要】This experiment is to conduct the test of toxicity,the immune organs index and blood cells conventional index and lymphocyte rose wreath formation rate on experimental level mice by using different concentrations of IRPS.Experimental results show that,in a definition concentration,IRPS has no obvious polysaccharide and side effects,but can effectively improve the body＇s immune system activity.%本试验采用不同浓度的板蓝根多糖对实验级的小白鼠进行了毒性试验,测试了免疫器官指数、血细胞常规指数及淋巴细胞玫瑰花环形成率等试验指标。结果表明,在一定浓度范围内板蓝根多糖不仅对机体无明显毒副作用,而且能有效提高机体的免疫系统活性。 【期刊名称】《绵阳师范学院学报》 【年(卷),期】2012(031)002 【总页数】6页(P75-80)

【关键词】板蓝根多糖;毒性试验;免疫系统 【作 者】王宏艳;麻延峰;周文仙

【作者单位】金华职业技术学院,浙江金华321017;金华职业技术学院,浙江金华321017;金华市婺城区畜牧兽医局,浙江金华321000 【正文语种】中 文 【中图分类】R285.5;R965

板蓝根(indigowoad)为十字花科植物菘蓝(Isatisindigotica fort)的干燥根，是中国传统中药，始载于《神农本草经》。性寒味苦，有清热解毒、凉血消肿的功效［1-2］。板蓝根含靛蓝，多种氨基酸，另含有12%氨基酸的蛋白多糖。多糖(polysaccharide)是指聚合度超过10以上的多聚糖，其分子量按聚合度不同而有很大差异，从数千到数百万之间，具有许多重要的生物活性，如参与细胞骨架的构成，也是多种内源性生物活性分子的组成成分［3］，是生物体内普遍存在的一大类生物大分子。近年来，各国学者从各种生物体内提取出了大量生物活性多糖，研究结果表明其具有提高机体免疫力、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗菌、抗炎、降低血脂、抗病毒、抗衰老以及改善动物生产性能等一系列作用。其中多糖的免疫调节作用是主要的，因此又叫免疫活性多糖［4］。板蓝根多糖(Isatisroot

polysaccharide，IRPS)是板蓝根中含量较多的、免疫活性较强的一类物质［5］。本试验对板蓝根多糖进行毒性试验，并测试了免疫器官指数、血细胞常规指数及淋巴细胞玫瑰花环形成率等试验指标，以确定板蓝根多糖在临床上的应用价值。 板蓝根购自金华市尖峰大药房。按照常规水煮醇沉法进行提取，取板蓝根饮片250 g煎煮2遍，第1遍加2500 ml蒸馏水微沸煎煮2 h，趁热过滤，第2遍加2000 ml蒸馏水微沸煎煮1.5 h，趁热过滤。合并两次所得滤液浓缩至200 ml加入无水乙醇800 ml，调整醇浓度80%。静置过夜，弃去上清液将所得沉淀物溶于100 ml蒸馏水中，加入400 ml无水乙醇调整最终含醇量为80%，静置过夜，弃去上清液，将沉淀物在60℃恒温干燥箱中烘干，称重得5 g板蓝根多糖。使用前用双重蒸馏水配制成1 ml含多糖0.067 g，高压灭菌，4℃冰箱保存备用［6-7］。 清洁级昆明小白鼠由金华职业技术学院兽医院提供(自繁自养)。体重18～22 g，鼠龄为6～8周。雌雄各半。

将板蓝根多糖用双蒸水配制成5个浓度，选取30只小白鼠(体重为20±2 g)分成6组，每组五只，第六组为空白对照组，注射生理盐水，其余五组分别用上述不同浓

度的板蓝根多糖腹腔注射，每只各2 ml，相同饲养生活条件，饲养两周时间，观察小白鼠的活动情况，对参试小白鼠进行称重，采血检测红细胞、白细胞数。采血完毕后，即进行第一颈椎脱臼致死，打开腹腔，观察肝、肺、脾的形态学变化，并取出其免疫器官脾脏，用滤纸吸干血液后称重，计算出脾脏和体重之间的比值(即为脾脏指数)［2］。通常用脾脏指数来反映机体的免疫功能，脾脏指数低则表示机体的免疫能力低下，反之则表示免疫功能增强。同时，采集肝脏、肺脏和脾脏制作组织切片，观察这些内脏器官的组织学变化。

淋巴细胞悬液的制备:抓取小白鼠取血，每毫升加20 IU肝素(200 IU/mL肝素生理盐水溶液)抗凝。取抗凝血1 mL，加入Hanks＇液1 mL，混匀后加在1 mL淋巴细胞分离液上，2500 r/min，离心10 min，吸出细胞悬液，用Hanks＇液洗涤2次，弃上清，将沉积细胞用pH7.4含10%小牛血清和HanKs液配成1×106～2×106个的细胞悬液。

红细胞悬液的制备:新鲜采集的绵羊血液用生理盐水洗涤、配成1%的绵羊红细胞悬液。

淋巴细胞与红细胞的作用:取0.1 mL淋巴细胞悬液与0.1 L绵羊红细胞悬液，置37℃水浴5 min，500 r/min，离心 5 min，置 4℃冰箱 1-2 h。［9］ 制片观察:取淋巴细胞与红细胞作用后的细胞悬液1滴放置玻片上，瑞-姬染色3 min，显微镜观察。凡一个T淋巴细胞吸附3个或3个以上绵羊红细胞的花结即为一个Et-玫瑰花环，计200个淋巴细胞数，求出Et-玫瑰花环结合率。

不同浓度的板蓝根多糖对小白鼠进行腹腔注射，饲养两周后，所有小白鼠全部存活，且均未出现异常。如表1:

不同浓度的板蓝根多糖对小白鼠进行腹腔注射，饲养两周后，抽血进行红细胞计数，结果表明，红细胞数无明显变化。如表2:

不同浓度的板蓝根多糖对小白鼠进行腹腔注射，饲养两周后，抽血进行白细胞计数，

结果表明，白细胞数虽有所变化，但差异不显著。如表3:

实验后对所有小白鼠进行第一颈椎脱臼致死，打开腹腔观察肺脏、肝脏、脾脏的变化情况，发现各组的小白鼠均未出现出血、充血等病理现象，随机抽取肺脏、肝脏、脾脏等样本制作切片均无病理变化，说明该浓度范围内板蓝根多糖对机体无明显毒副作用。

不同浓度的板蓝根多糖对小白鼠进行腹腔注射后，两周后第一颈椎脱臼致死，取脾脏称重，并计算脾脏指数。如表4:

脾脏是机体重要的免疫器官，脾脏也是动物体内最大的免疫器官，B细胞约占60%，T细胞约占40%。因此，脾脏指数在一定范围内可以直接反映机体的免疫功能的强弱，即可反映机体非特异性免疫水平。由表4可见，板蓝根多糖能够有效地提高小鼠脾指数，说明板蓝根多糖可以明显提高小白鼠机体的免疫功能。 动物T淋巴细胞表面具有结合异种动物红细胞的受体，称为E受体。在体外一定条件下，能与绵羊等动物的红细胞结合，形成以T细胞为中心，红细胞环绕在周围，宛似一朵玫瑰花样的花环，称E-玫瑰花环试验。该环可在光学显微镜下鉴别。一般玫瑰花环试验结果以玫瑰花环阳性细胞数/受检细胞总数乘以百分比，或直接计数100个淋巴细胞中花环的个数。由于早期玫瑰花环形成的T淋巴细胞是对绵羊红细胞具有高度亲和力的T细胞亚群，它与T细胞的体内外功能活性密切相关，而T-淋巴细胞在机体内主要参与特异性免疫，因此，玫瑰花环试验能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化，是目前检测细胞免疫水平最为简便快速的方法之一［9］。不同浓度的板蓝根多糖对小白鼠进行腹腔注射，饲养两周后，在致死前采血，进行ERFC形成试验，结果如表5:

从表5中可看出，注射IRPS的低、中、高剂量组与对照组相比，具有统计学意义(P＜0.05)。小白鼠接受板兰根多糖注射后，在此浓度范围内，浓度越高，E-玫瑰花环形成率也越高。一般认为，玫瑰花环形成率越高，血液中T-淋巴细胞的比率

也就越高，免疫功能越强［10］。

(1)急性毒性试验结果所有小白鼠全部存活，红细胞数无变化，白细胞数虽有所变化，但差异不显著，心脏、肝脏、脾脏等均未发现出血、充血等病理现象，组织学观察也未见异常，说明该浓度范围内板蓝根多糖对机体无明显毒副作用，这与张明［11］等的研究在动物体内摄入一定范围内中药多糖是安全可靠的结果相一致，也进一步证实了多糖是通过宿主中介起作用，所以多糖药物没有细胞毒性，不影响正常细胞。因此，有人称“未来的数十年是多糖的时代”［12］。

(2)不同浓度板蓝根多糖对脾脏指数的影响试验表明，板蓝根多糖能够有效地提高小鼠脾指数，说明一定浓度的板蓝根多糖能刺激小白鼠脾脏的生长，这与李炳奇［13］等的报道相一致，脾、肝、胸腺的指数与对照组相比，差异极显著(P＜0.01)，肾的指数较对照组差异显著(P＜0.05)，说明多糖在免疫器官的增重方面发挥重要作用。

(3)不同浓度板蓝根多糖对小白鼠淋巴细胞玫瑰花环形成试验证明，通过注射不同浓度的板兰根多糖，发现能显著促进淋巴细胞生成，提高T淋巴细胞玫瑰花环的形成率，从而证明板兰根多糖可提高机体的免疫功能，为板兰根多糖的开发及临床应用提供依据［13-14］。

(4)玫瑰花环试验应在无菌采血后3-4 h进行检验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。控制好反应温度、时间等条件对玫瑰花环形成率有较大影响。选37℃作用10 min，低速离心5 min，置4℃，其结果稳定性较好，结合率较高。如在37℃作用时间较长，可见玫瑰花环发生变形，结合部位松弛、拉开，甚至解离。加犊牛血清能增加玫瑰花环形成细胞的稳定性，增强与指示红细胞结合的牢固性［14］。另由于实验条件等因素限制，本试验仅以0.067 g.ml-1为主配置了五个浓度，在何种浓度、剂量范围内，IRPS的浓度越高，效果越明显，还需

进一步的研究。

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