PCP对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选

PCP对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选

姓名：王少华申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：吴坤20060601

微生物学硕上论文五氯酚对十壤微乍物ｆ；（系影响及ｊ￡降解菌的筛选摘要五氯酚（ｐｅｎｔａｃｈＬｏｒｏｐｈｅｎｏＬ，简写为ＰＣＰ）及其钠盐被广泛应用丁木材、皮革的防腐，杀菌，除草，杀虫，消毒，杀灭钉螺等。在土壤中的残留最很大，给环境造成了严重的危害。作为一种有毒有害有机物，已被许多国家列入优先污染物。因此研究ＰＣＰ与土壤微生物的生态关系对了解ＰＣＰ在环境中的代谢迁移以及研究ＰＣＰ的生物降解都有重要的意义。文章利用平板分离培养和１６ｓＲＮＡ基冈片段扩增研究ＰＣＰ对土壤微生物的影响。首先用平板培养的方法研究了ＰＣＰ对可培养微生物的影响。试验得出，ＰＣＰ对土壤微生物的数量有很大的影响：在１００ｍｇ－Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ～，５００ｍｇ・Ｋ９１时，对细菌有生长刺激作用，细菌数量上升很快，且持续时间比较Ｋ。在１０００ｍｇ．Ｋｇ。时，开始时细菌的生长有刺激作用，细菌数量有所增加，但随着时间延长，细菌数量开始下降，下降趋势比较大，最后甚至低于对照。在ｌＯＯｍｇ．Ｋ９１，２００ｒａｇ．Ｋｇｄ时，ＰＣＰ对放线菌有微弱的生长刺激作用，在５００ｍｇ・Ｋ９１，１００ｍｇ．Ｋｇ。时，ＰＣＰ对放线菌有强烈的抑制作用，放线菌的数量远低丁对照土壤。真菌对于ＰＣＰ的处理十分敏感，任何浓度处理下真菌的数量都低丁对照。虽然随着时间延长，真菌数量略有上升，但仍低于对照。这表明ＰＣＰ对真菌具有强烈的毒性。土壤酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一，土壤酶和十壤微生物一起共同推动土壤的代谢过程。故在检测微生物数量的同时，也测定了几种土壤酶的酶活。结果表明，ＰＣＰ对脲酶有较强的抑制作用，各处理脲酶酶活力均低丁对照。在１００ｍｇ．Ｋ９１，２００ｍｇ．Ｋｇ。时，ＰＣＰ对磷酸酶有刺激作用，导致磷酸酶酶活力上升，在５００ｍｇ．Ｋｇ～，１０００ｍｇ．Ｋ９１时，开始时磷酸酶酶活力有所‘卜．降，但随后酶活力又开始上升，并且高丁二对照。在１００ｍｇ．Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ‘１时，蛋白酶酶活力于对照相著不人，在５００ｍｇ・Ｋｇ＂１’１０００ｍｇ．Ｋｇ。１时，蛋白酶酶活力远低于对照。土壤中脲酶，磷酸酶，蛋白酶对ＰＣＰ的敏感程度为：脲酶＞蛋白酶＞磷酸酶。可培养微生物仅占自然环境微生物的极少部分，用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ研究ＰＣＰ处理过的土壤获得不可培养培养微生物的信息，更全面的了解ＰＣＰ对土壤微生态的影响。从ＤＧＧＥ的结果可以得出，ＰＣＰ处理后的土壤，条带的种类和亮度都有显著的变化。它反映了处理体系中微生物区系的变化，特别是对ＰＣＰ有降解和耐受能力有关菌类的发育过程。利用Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅｏｎｅ软件对ＤＧＧＥ图片进行分析，通过比较可发现，低浓度之间有较高的相似性，高浓度之间的相似性变化较大，而高浓度和低浓度之间有较低的相似性。由此可以得出ＰＣＰ对七壤微生物区系的有比较明显的影响，而且随着ＰＣＰ浓度的升高，这种影响也越大。试验从经过ＰＣＰ处理的土壤中筛选ＰＣＰ的降解菌，并对该菌做了鉴定和降解效果的测定，为今后在生产实践中运用该菌提供了理论和实施依据。通过平板筛选和摇床发酵对比筛选剑了一株ＰＣＰｆｌ勺降解菌株，可以．｝｛ｊ＋Ｊ】：ＰＣＰｔ＇ＩＯ降解研究。该菌株在ＤＧＧＥ图谱中也有对照条带为优势菌群。通过革兰氏染色，１６ｓＲＮＡＶ３条带的测序对比可以确定所筛选到的菌为假单微生物学坝ｆｊ论文五氯酚对十壤微生物区系影响及１￡降解菌的筛选胞菌属。通过摇瓶发酵对该菌的降解效率和影响降解的冈素作了初步测定。结果如下，该菌具有较好的降解效果，舜ｊ３００ｍｇ．Ｋｇ－１的ＰＣＰ在３６ｈ内的降解效率可以达到１００％，在５００ｍｇ．Ｋｇ一１的情况下３６ｈ降解效率也可达到９０％以上。接种量为３ｍＬ可以使ＰＣＰ得到较好降解。添加微量浓度的葡萄糖．温度３０＂Ｃ，ｐＨ值－旱弱碱性，添加０．２％的吐温－８０有助于ＰＣＰ的降解。关键词：ＰＣＰ土壤微生物土壤酶ＰＣＲ．ＤＧＧＥ假单胞菌降解微生物学硕。ｆ：论文五氯酚对ｆ：壤微生物区系影响及其降解菌的筛选ＡＢＳＴＲＡＣＴＴＨＥＥＦＦＥＣＴＳｏＦＤｌＦＦＥＲＥＮＴＣｏＮＣＥＮＴＲＡＴＩｏＮｏＦＰＣＰｏＮＴＨＥＳｏＩＬＭＩＣＲｏＦＬｏＲＡＡＮＤＴＨＥＳＣＲＥＥＮＩＮＧｏＦＰＣＰＤＥＧＲＡＤＩＮＧＢＡＣＴＥＲＩＡＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＷｕＫｕｎＳｈａｏｈｕａＭａｓｔｅｒ（Ｐｈ．Ｄ）Ｃａｎｄｉｄａｔｅ：ＷａｎｇＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｔｈｅｅｃｏｌｏｇｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｅｓｔｉｃｉｄｅａｎｄｔｈｅａｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｉｓｂｅｃｏｍｉｎｇｈｏｔｓｐｏｔｉｎｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｐｏｌｌｕｔｅｄｅｃｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｏｎｅｐｅｓｔｉｃｉｄｅｗａｓｐｒｏｄｕｃｅｄｆｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｐｅｓｔ，ｂｕｔｉｎｆａｃｔｉｔｉｓｎｏｔｅｘｉｓｔ．Ｏｎｔｈｅｐｅｓｔｉｃｉｄｅｉｓｖｅｒｙｃａｕｓｅｄｈａｎｄｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｃｒｏｐｏｕｔｐｕｔ；ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ｉｔｓｅｒｉｏｕｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｐｏｌｌｕｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｓａｆｅｔｙｏｆｐｅｓｔｉｃｉｄｅａｎｄｉｔｓｅｃｏｌｏｇｙｅｆｆｅｃｔｓ．ＰＣＰｈａｓｂｅｅｎｌｉｓｔｅｄａｓａａｓａｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｐｏｌｌｕｔａｎｔｂｙｍａｎｙｃｏｕｎｔｒｉｅｓｐｏｉｓｏｎｏｕｓｏｒｇａｎｉｃｈａｌｉｄｅ．ＰＣＰ—Ｎａｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄａｓｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓ，ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ，ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ，ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｏｆｗｈｏｒｌｅｔｃ．Ｔｈｅｒｅｓｉｄｕｅａｎｄｉｎｔｈｅａｎｔｉｓｅｐｓｉｓｏｆｗｏｏｄａｎｄｌｅａｔｈｅｒ，ｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｃａｕｓｅｄｓｅｒｉｏｕｓｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｓｏｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｂｏｕｔｔｈｅｅｃｏｌｏｇｙｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｐｃｐｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏａｎｄｓｏｉｌｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｔｒａｎｓｆｅｒｅｎｃｅａｎｄｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｃｐ．ＷｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｕｓｅｄｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｃｐｔＯｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｉｎｍｅｔｈｏｄｃａｎｔｗｏｓｉｄｅｓ．Ｆｉｒｓｔ，ｗｅｐｌａｔｅｃｕｌｔｕｒｅｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｃｐｏｎｆｏｒｃｕｌｔｕｒｅｄｔｈｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ．ＴｈｒｏｕｇｈｔｈｅｔｅｓｔｗｅｇｅｔｔｈａｔＰＣＰｈａｓｇｒｅａｔｅｆｆｅｃｔｑｕａｎｔｉｔｙａｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｃｒｅａｓｅｄｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｌａｓｔｅｄｆｏｒｌｏｎｇｔｉｍｅｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｃｐｉｓ１００ｍｇ．Ｋｇ一，２００ｍｇ．Ｋｇ～，５００ｍｇ．Ｋｇ－１．Ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉａｉｎｃｒｅａｓｅｄａｔｆｉｒｓｔ，ｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｔｌａｓｔｉｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｅＣＫｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＰＣＰｉｓ１０００ｍｇ．Ｋｇ～．ＷｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａＰＣＰｉｓ１００ｍｇ・Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ－ｌ，ｉｔｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｌｉｔｔｌｅ．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓＷａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＰＣＰｉｓ５００ｍｇ・Ｋｇ－‘，１００ｍｇ．Ｋｇ＂１．ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓｉｓｆａｒｌｏｗｅｒｔｈａｎＣＫ．ＴｈｅａｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｈｏｕｇｈｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｉｔｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆｆｕｎｇｉｉｓｌｏｗｅｒｔｈａｎＣＫａｔｇｒｏｗｉｎｇａｓｔｈｅｔｉｍｅｐａｓｓｅｄ．ＩｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＰＣＰｈａｓｓｔｒｏｎｇｔｏｘｉｃｉｔｙｓｏｉｌｆｕｎｇｉ．Ｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅｉｓｔｈｅｍｏｓｔａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｓｏｉｌ，ａｌｏｎｇｗｉｔｈｔｈｅｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ微生物学硕七论文五氯酚对十．壤微牛物Ｋ系影响及ｌ￡降解菌的筛选ｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｓｏｉｌｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｓｏｗｅｃｈｅｃｋｅｄｔｈｅｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｔｏｏ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｐｅｐｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｕｒｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．ＴｈｅｕｒｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎＣＫａｔａｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＰＣＰｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｃｐｉｓ１００ｍｇ・Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇｑ，ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＣＫ；ｗｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｅｐｉｓ５００ｍｇ・Ｋｇ～，１０００ｍｇ・Ｋｇ－ｌ，ｆｉｒｓｔｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｌｏｗｅｒｔｈａｎＣＫ，ｔｈｅｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＣＫ．Ａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１００ｍｇ．Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ一，ｔｌｌｅｐｒｏｔｅａｓｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙＷａｓｅｑｕａｌｔｏＣＫ，ｂｕｔｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｌｏｗｅｒｔｈａｎＣＫａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５００ｍｇ．Ｋｇ～，１０００ｍｇ・Ｋｇ＂１．Ｉｎａｌｌ，ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅｔｏＰＣＰｉｓ：ｕｒｅａｓｅ＞ｐｒｏｔｅａｓｅ＞ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ．ＭｏｓｔｏｆｔｈｅｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＣａｎｎｏｔｂｅｃｕｌｔｕｒｅｄｎｏｗ，ＳｏｗｅｕｓｅｄＰＣＲ—ＤＧＧＥｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｓｏｉｌｓａｍｐｌｅｓｉｎｏｒｄｅｒｔｏｇｅｔｔｈｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍａｎｄａｎｔｉｃｉｐａｔｅｔｏｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｍｏｒｅａｂｏｕｔｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＰＣＰｆｏｒｓｏｉｌｅｃｏｌｏｇｙ．ＴｈｒｏｕｇｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＧＧＥｗｅｃａｎｇｅｔｔｈａｔｔｈｅｎｕｍｂｅｒａｎｄｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓｏｆｔｈｅｂａｎｄｓｃｈａｎｇｅｄｒｅｍａｒｋａｂｌｙａｆｔｅｒｔｈｅｄｉｓｐｏｓａｌｏｆＰＣＰ．Ｉｔｒｅｆｌｅｃｔｅｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｆｉｏｒａ，ｅｓｐｉｃａｌｌｙｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｔｈａｔＣａｎｄｅｇｒａｄｅｏｒｔｏｌｅｒａｎｔｔｏＰＣＰ．ＷｅｕｓｅｄｔｈｅＱｕａｎｔｉｔｉｖｅｏｎｅｓｏｆｔｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｐｉｃｔｕｒｅｏｆＤＧＧＥ．ＷｅＣａｎｇｅｔｔｈａｔｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓｈｉｇｈ，ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓｌｏｗ，ｔｈｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌｏｗａｎｄｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓｌｏｗ．ＳｏｗｅｃａｎｃｏｎｃｌｕｄｅｔｈａｔＰＣＰｈａｓｇｒｅａｔｅｆｆｅｃｔｓｏｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ，ｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅ，ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｂｅｃａｍｅｂｉｇｇｅｒ．ＡｔｌａｓｔｗｅｓｃｒｅｅｎｅｄａＰＣＰｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｔｈｅｓｏｉｌｄｉｓｐｏｓｅｄｂｙＰＣＰ．Ｗｅａｌｓｏｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｉｓｓｔｒａｉｎａｎｄｔｅｓｔｅｄｉｔｓｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅ．Ｔｈｒｏｕｇｈｐｌａｔｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｅｇｏｔｔｈｉｓｓｔｒａｉｎ．ＩｔＷａｓａｄｏｍｉｎａｔｅｄｂａｎｄｉｎｔｈｅｄｇｇｅｐｒｏｆｉｌｅ．ＴｈｒｏｕｇｈＧｒａｍｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ１６ｓＲＮＡｗｅｃａｎｓｐｅｃｕｌａｔｅｔｈｅｓｔｒａｉｎｂｅｌｏｎｇｔｏＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．．Ｗｅｔｅｓｔｅｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅａｎｄｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｂｙｆｅｒｍｅｎｍｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓａｒｅａｓｆｌｏｌｌｏｗｓ：ｉｔｃａｎｂｅｔｏｔａｌｌｙｄｅｇｒａｄｅｄｌｙａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ３００ｍｇ・Ｋｇ＂１ｉｎ３６ｈ。Ａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５００ｍｇ・Ｋｇ。１ｉｔｃａｎｂｅｄｅｇｒａｄｅｄｆｏｒ９０％ｉｎ３６ｈ．Ｔｏｉｎｏｃｕｌｍｅ３ｍＬｗａｓｅｎｏｕｇｈｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＰＣＰ．Ａｄｄｉｎｇｌｏｗｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅａｎｄ０．２％Ｔｗｅｅｎ一８０，３０。Ｃ，ｐＨｉｓａｌｋａｌｅｓｃｅｎｃｅｃａｎｈｅｌｐｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＰＣＰ．Ｋｅｙｗｏｒｄ：Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＰＣＰ）；Ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；Ｓｏｉｌｅｎｚｙｍｅ；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．；Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ５２河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书学位论文题目五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选学学生姓名学位论文是否保密学位级别硕士王少华科专业微生物学导师姓名吴坤是如需保密，解密时间≯口口７年／月岁护日独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：歪步绎虢买导师签名：云勃甲日期０刀Ｄ锌石月１１白日期：弦Ｄ分＃６月，厂日学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同力式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则，承担相应的法律责任。位论文在解密后适用于本授权书。注：Ｆ鱼垦研究’０ｑ字℃牟新虢钟学院领导虢印建日期：加Ｄ６年‘月，厂曰日期：稚ｇ月，／日日期：≥汐口缉多月，／日致谢本文是在我的导师吴坤教授悉心指导下完成的，除了在选题、查阅文献、实验技术、论文写作等多方面的具体指导外，导师敏捷的思维，认真严谨、一丝不苟、勇于创新的治学精神深深感染着我，使我受益匪浅，此时此刻向吴老师表示最衷心的感谢！在实验过程中，贾新成教授、邱立友教授、宋安东副教授、陈红歌副教授、就实验中出现的问题提出过不少建议。徐淑霞老师、王明道老师、张世敏老师、刁东霞老师、赵柏叶老师、赵玉萍老师、胡渝老师为实验的顺利进行提供了诸多便利。从实验的开始到结束，和同学们的互相合作，使试验工作顺利进行，同时也和他们建立了深厚的友谊。南农的胡元森博士，师姐张红梅、窦会娟等在实验初始阶段给予很大帮助。在和杜国营、李林柯、孙连海等同学三年的共同学习和生活中，得到他们很多的帮助。师弟孙强、师妹郑茜等在实验上也给与了帮助。在此谨向关心和帮助我的老师和同学表示衷心的感谢。最后，谨将我的论文献给我的父母、哥哥和其他亲人以及我的朋友张晓宇。在我三年求学生涯中，是他们无私的鼓励和不懈的支持使我顺利完成了学业，是他们的爱使我有了应对困难一步一步走下去的勇气。最后，对关心、支持和帮助过我的所有的老师、同学、朋友和亲人表示最诚挚的谢意！王少华２００６年６月于郑州微生物学硕十论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选１文献综述１．１土壤微生物多样性研究土壤微生物多样性包括类群多样性、遗传（基囚）多样性及生态类型多样性等。微生物是自然界中分布最Ｊ“的一个生物类群，无论在高山、陆地、淡水、海洋、空气以及动植物体内外，都有微生物的存在；其数量庞大、种类繁多，是地球上仅次于昆虫的第二人类群的生物。土壤是微生物生活的良好环境，所以在十壤中微生物的数量和种类都很多。一般１鲫巴沃土壤中有几亿至儿十亿个微生物，而贫瘠的ｌｇ土壤中也有几百万Ｎ）Ｌ千万个微生物。微生物是生物中一群重要的分解代谢类群，其营养代谢类型的多样性决定了它能够利用各种不同的基质，适应各种生态环境并以不同的生活方式与其它生物相互作片ｊ。几乎所有自然的或生物合成的物质最终都由微生物降解，包括纤维素、半纤维素、木质素、难降解的卤素苯环化合物等对于其它生物米说是营养极限的物质【１＇２１。尤其是在各种厌氧环境中，微生物进行着必要的物质转化，维持着自然生境的物质循环，其作用是其它生物无法替代的。十壤微生物类群的变化，势必要影响剑十壤中具有生理、生化活性物质的种类和数量发生变化；所以十壤微生物的活性可以在一定的程度上反映土壤肥力１３，４Ｊ，是土壤质鼙评价的一项重要的生物学指标。通过检测土壤微生物数量和种类的多少，就可以初步判断十壤质量的高低。１．２土壤酶多样性研究土壤酶主要来源丁植物根系及其残体、土壤动物及其遗骸和微生物的分泌。按照土壤酶的催化反应类型和功能主要分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂合酶等四大类，其中研究最多的是水解酶中的转化酶、脲酶、磷酸酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等，氧化还原酶类中的过氧化氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、脱氢酶等与士壤肥力关系密切的酶。土壤酶主要存在于＿十壤微生物和植物根系表面、土壤中死亡的机体碎片，生物代谢产物和土壤颗粒上；其存在的状态主要以游离态存在于土壤悬浮液中或以物理或化学结合的形式吸附在土壤有机或无机颗粒上或与腐殖质络合而长期地积累于土壤中。现在用一般的方法测得的土壤酶活性是具有一定稳定性的积累酶（稳定态胞外酶）活性。因为在微生物繁殖中产生的酶和未与十壤成分结合而处于游离状态的酶，性质不稳定，容易在环境条件改变时被钝化，所以繁殖酶和游离酶在十壤中被检测到的数量较少。土壤酶活性是土壤的本质属性之一，是决定土壤代谢的重要冈素，它直接影响着士壤内的物质转化，可以反映十壤中进行的各种生物化学过程的强度和方向。虽然单一种类的十壤酶催化具有专一性，仅反应十壤某一特殊的生化过程，不能作为土壤肥力评价的标准，但十壤中酶的来源和种类多样，且在各土壤酶之间有一定的内在关系。所以可以用与土壤主要肥力冈素有关的、分布最ｆ“的儿个关键酶类的活性总体来表征土壤的肥力水平ｐｌ。尤其是十壤中的过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶、脲酶、蛋白酶、多酚氧化酶活性之间的关系及总体活性对评价．十壤肥力水平有重要意义‘６１。土壤生态环境的改变则必然影响十壤酶活性的改变。所以在－十壤生态系统的研究中，十壤酶活性的检测似乎是必不可少的内容。微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选１．３土壤微生物多样性研究方法进展１．３．１土壤微生物多样性概念及研究方法分类土壤微生物多样性是指微生物在遗传、物种和生态系统层次上的变化。它代表着微生物群落的稳定性，也反映十壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。土壤微生物多样性还可以定义为微生物生命的丰富性，通常以十壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互关系来反映。多样性包括二部分内容：微生物数量（丰富度）和相对丰富程度（均匀度）【＿７１。丰富多样的微生物种类不仅是维持土壤健康的重要因素，其多样性的变化也是监测十壤质量变化的敏感指标瞵Ｊ。土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为两类：一类是用于分析土壤中可培养的微生物群落：另一类是用于分析土壤的整个微生物群落。下面仅对有关土壤微生物多样性几种主要的实验研究方法加以介绍与评述。１．３．２土壤微生物研究方法１．３．２．１传统的微生物培养法传统的微生物培养法就是根据目标微生物选择相应的培养基，然后通过各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分析鉴定。对于十壤微生物，由于方法上的限制和微生物自身的变异性，目前还不可能将土壤中的全部微生物培养出来，而且对于＿十壤微生物种属的鉴定分类也是一件不易的上作。冈此，在实际研究中，通常从某一侧面或某一角度来近似或间接地描述土壤微生物的多样性状况。如从土壤微生物类群——细菌、真菌和放线菌三人类群的数量及其比例组成来描述；或从某一类群或者优势微生物种类组成及其数量来研究土壤微生物多样性，如对土壤中的固氮菌、根瘤菌、菌根菌、产甲烷细菌等的多样性进行研究。然而，培养基的成份显著影响微生物的生长状况，培养条什的人为选择也强烈影响所得菌落的多样性【９１。平板培养得剑的菌落形成单位．（ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ，ＣＦＵ）的数量通常随培养基营养浓度的降低而增加ｆｍＩ。许多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的０．１％．１０％１¨１。传统的研究方法只能反映极少数微生物的信息，所测结果误差较大，大大低估了土壤中微生物群体的多样性水平ｆ１２】。此外，用平板培养法得到的微生物种群能否代表整个微生物群体或此群体中的生态活跃部分也未可知。因此这种传统的研究方法只能作为一种辅助手段，并且只有与其他先进方法结合起米才能较为客观而全面的反映微生物群落结构的真实信息。但这种方法在分离具有一定功能的特殊目标物种时是非常有用的。１．３．２．２ＢｉｏＬｏｇＢｉｏＬｏｇＧＮ方法ＧＮ分析方法是一种群落水平的生理特性分析方法。它是基丁测定土壤微生物对９５种不同Ｃ源的利ＨＪ能力及其代谢差异，进而Ｈｊ以表征土壤微生物代酣功能多样性或结构多样性的一种方法。ＢｉｏＬｏｇＧＮ微滴定板的９５个孔中每孔含有一种不同的碳源、其它营养物和四氮唑染料。接种微生物悬浮物丁微滴定板孔中后，将滴定板保温一段合适的时间ｉ２微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选通过测定伴随的四氮唑染料的还原，而定期监测底物的氧化。由丁不同微生物对不同单一碳源利用程度和强度不一样而发生不同生化代谢反应，最终使得每一个孔的溶液呈现出不同程度的颜色，微平板中每一孔的颜色变化可以通过酶标仪测定和记录卜．米，这样便可得到十壤微生物特有的“代谢指纹”（ＭｅｔａｂｏｌｉｃＦｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）。根据土壤微生物的代谢指纹图谱，结合有关的计算机分析软件和已有的菌种库资料，可以得到某些微生物的分类鉴定。Ｇａｒｌａｎｄ等ｌｌ３】首先报道了这种碳源利用信息可把一些不同种类的土壤和水体的微生物区系区别开。Ｚａｋ等【１４】把这种系统作为一种定量方法用米评价与６种植物区系相关的微生物群体的功能多样性。近年来，Ｂｉｏｌｏｇ系统已广泛应用在不同生态类型的十壤微生物群体研究中。ＢｉｏｌｏｇＧＮ方法具有快速而可再现的特点．然而，该方法对快速生长和适合在实验条件下生长的小部分群落成员有强烈的选择性Ｉｌ引，故与从琼脂平板分离微生物的传统方法有同样的局限性；另一缺点是被测试的底物不能准确地代表出现丁生态系统中的底物类型，因而人大低估了土壤中微生物的实际情况，故许多学者建议在使用Ｂｉｏｌｏｇ微平板法时，需要结合其他方法，以获得更全面的结果。１．３．２．３生物标志物（Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）法使用生物标志物来定量描述土壤微生物的群落结构组成是最常用的方法之一。这种生物标志物通常是微生物细胞的生化组成成分或是细胞外分泌产物。当测定十壤中这些化合物时，首先使用一种合适的提取剂直接把其从土壤中提取出来，然后对提取物进行纯化后用合适的仪器加以定晕测定。用这种方法来定量描述土壤微生物的群落结构组成的优点是既不需要把微生物的细胞从环境样中分离，同时义能克服由丁对微生物培养而导致不同微生物种群可能会发生选择性生长所造成的麻烦。目前，磷脂脂肪酸图谱分析（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｆａｔｔｙａｃｉｄ，ＰＬＦＡ）、脂肪酸图谱（ＦａｔｔｙＭＦＡ）以及甲基脂肪酸酯谱图（Ｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌａｃｉｄ，ｅｓｔｅｒ，ＦＡＭＥ）分析在群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的５％。在细胞夕匕亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合丁．微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。Ｈａａｃｋ等１１６】通过试验结果表Ｉ】ｆｊＦＡＭＥ谱图法能够监测土壤微生物群落细微变化。Ｗ．１ｋｉｎｓｏｎ和ＡｎｄｅｒｓｏｎＩ＂Ｉ用ＰＬＦＡ谱图法研究了微生物群落与树木根系的关系。目前，ＦＡＭＥ谱图分析已成为十壤微生物多样性的较为常用研究方法之一。ＰＬＦＡ方法是一种快速、可靠而可重现的分析十壤微生物群落结构的方法，可Ｊ｝ｊ丁．表征在数餐上占优势的土壤微生物群落，包括不可培养微生物。该方法最适合用作总微生物群落分析，而不是专一的微生物种类的研究。然而，ＰＬＦＡ方法也有自身的缺限，女ＨＰＬＦＡ的组成和浓度受士壤微生物生长条件和生理状态的影响Ｉｌ８｜．不同属共至不同科的微生物的脂肪酸可能重叠．所以以磷脂类组成米鉴定区分关系较远的微生物有一定的肉难１１９１。该方法另一个缺陷是实验条什要求高，耗时ｌｊ＝：，成本高，冈而在实际研究．ｊ：作中常受到一定的限制。３微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选１．３．２．４分子生物学方法从土壤微生物群体基因组水平研究士壤微生物的多样性及其功能是近年米发展起来的一种新思路。其技术路线是首先从土壤微生物体中有效的提ＤＮＡ或ＲＮＡ，经过纯化后用ＰＣＲ专一性扩增特定ＲＮＡ片段，然后对ＰＣＲ产物进行电泳分离、探针杂交、及分子克隆等系列操作，最后对获得的电泳图谱或核酸序列进行生物信息学分析。分子生物技术方法可以克服传统培养法造成的信息人量丢欠的缺点，能够更全面更客观的对样品进行分析，更精确地揭示－十壤微生物种类和遗传多样性。近年米以分子生物学技术为基础发展起来的ｒＤＮＡ及ＲＮＡ的分析方法主要有：随机引物扩增多态性（Ｒａｎｄｏｍ核糖体ＤＮＡ限制性分析（ＡｍｐｌｉｆｉｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ），扩增ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ，ＡＲＤＲＡ），１６ｓＲＮＡｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈ末端标记限制片段长度多态性（Ｔｅｒｍｉｎａｌ单链构象多态。Ｉ生（Ｓｉｎｇｌｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，Ｔ—ＲＦＬＰ），ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．ＰＣＲ－ＳＳＣＰ），肠杆菌基因间的重ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ，复共有序ＹＪＪ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｄａｌ泳（ＤｅｎａｔｕｒｉｎｇｐｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃＥＲＩＣ．ＰＣＲ），变性梯度凝胶电ｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＤＧＧＥ；Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＴＧＧＥ），宏基因组（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）的测序等。１）土壤微生物基因组ＤＮＡ提取以分子生物学为基础的土壤微生物多样性分析过程中，土壤微生物基因组的提取是关键。ＤＮＡ提取大致分为两种，即直接方法和间接方法。直接方法是对－十样中的微生物细胞进行直接裂解，使ＤＮＡ释放出来。间接方法首先把十样中的微生物细胞提取出来，然后再进行微生物细胞ＤＮＡ的提取。Ｋｏｚｄｒ６ｊ￥ｌｌＶａｎＥｌｓａｓ【２０Ｊ比较了两种直接提取法和两种间接提取法获得的ＤＮＡ质量。直接法的特点是所获得的粗ＤＮＡ量较大，提取效率高，但所含的杂质较多。间接法得到的ＤＮＡ含量低，但纯度高。随后的ＤＧＧＥ分析表明，两种方法得剑的图谱高度相似，都能满足对土壤微生物群落多样性的监测。土壤中ＤＮＡ提取效率及提取质量还与十壤类型和土壤有机质含量有关。为了获得高产量的ＤＮＡ人们采用超声波、机械破碎、冻融处理来增加细胞的溶解纠２１】。２）ＲＡＰＤＲＡＰＤ是最先Ｉ扫Ｗｉｌｌｉａｍｓ等【２２１提出的，以检测多态ＤＮＡ为目的一项分子遗传标记技术。它以人Ｔ随机合成的ＤＮＡ分子为引物，以基冈组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术对多态性ＤＮＡ片段随机合成。如果某一引物分子与某一片段ＤＮＡ模板具有互补的核酸序列，该引物分子就会结合到单链的ＤＮＡ模板上，通过ＤＮＡ聚合酶连接，合成一段新的］卧Ｉ＇ＤＮＡ链。对整个基冈组的ＤＮＡ分子而言，某一引物可能会与单链ＤＮＡ的许多地方结合，结果基冈组的许多位点同时得以扩增。一些表型上不能反映的遗传物质的细微的变化都可以通过ＲＡＰＤ技术显示出米。Ｙａｎｇ掣２３】用ＲＡＰＤ方法分析了农业化学污染物（三双甲酮、碳酸氢铵及其中间产物）对４个＋壤微生物群落的ＤＮＡ序列多样性的影响，用１４个随机引物，有１２个引物扩增出共１５５个可靠的片段，其中１３４个具有多态性，经过对ＤＮＡ序列多态性的分析币ＩＩＤＮＡ４微生物学硕十论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选丰度、修饰丰度、Ｓｈａｎｎｏｎ．Ｗｅａｖｅｒ指数和相似性系数的计算，结合土壤微生物生物量的测定，结果表明农业土壤化学物质可在ＤＮＡ水平上影响微生物多态性。其主要特点是：（１）与ＲＦＬＰ法相比，ＲＡＰＤ法所需的模板量少，操作快，不需要知道ＤＮＡ序列信息，并且获得基冈图谱较迅速，标记密度较人。（２）ＤＮＡ样品需要量较少，引物价格便宜，成本较低。这种方法存在的主要弊端就是实验重复性较差，结果可靠性较低。３）ＡＲＤＲＡＡＲＤＲＡ是对１６ｓＲＮＡ基冈扩增产物进行分析的一种简便有效的方法。首先用ＰＣＲ方法从土壤和微生物分离菌中扩增１６ｓＲＮＡ，扩增产物用一种或几种限制性酶消化，所得片段用凝胶电泳分离，对获得的电泳图谱分析即可知该样品中一些微生态信息。Ｓｍｉｔ等【２４１用ＡＲＤＲＡ的方法研究了Ｃｕ污染对土壤微生物群落多样性的影响，ＡＲＤＲＡ图谱显示在Ｃｕ污染土壤中微生物多样性明显减少并且群落结构发生很大变化，但Ｃｕ污染对氨氧化菌的多样性没有影响。ＡＲＤＲＡ所获得的谱带更为简单，易于分析，但是所能获得的信息量也相对较少，并且难以用来评估物种的丰富度和均匀度。４）Ｔ—ＲＦＬＰ实际上，Ｔ—ＲＦＬＰ方法是ＡＲＤＲＡ方法的进一步发展。由于１６ｓＲＮＡ的限制性片段长度多态性分析似ＲＤＲＡ）所产生的片段多，分析起来工作量人，人们在此基础上又发展了一种高效、灵敏的方法。该方法在用细菌通用引物ＰＣＲ扩增１６ｓＲＮＡ基冈时，在其中一条引物的５’末端用荧光素进行标记，然后对十壤样品ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。扩增产物１６ｓＲＮＡ经特定限制性内切酶消化后可通过电泳分离，在计算机程序自动分析时仅分析荧光标记的末端限制片段，这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化并且每个可』＾！－的条带都代表一个“核型”或一个分类单元陋２６Ｉ。Ｔ．ＲＦＬＰ是研究十壤微生物多样性和结构的一种有效而快速的手段。它克］］艮ＴＡＲＤＲＡ方法Ｔ作晕大、分析烦琐的缺点，同时又保留了ＡＲＤＲＡ方法分析精度高、能获得土壤微生物系统发育信息的优点，是一种较为理想的方法。Ｃｌｅｍｅｎｔｌ２７１等成功地用Ｔ．ＲＦＬＰ方法比较了术受污染沙地、石油污染沙地和鹿粪中的微生物群落多样性。５）ＰＣＲ．ＳＳＣＰＰＣＲ—ＳＳＣＰ方法本来是用丁临床鉴定基冈突变，近年来被虑片ｊ到微生物生态学的研究【２８】。单链ＤＮＡ片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单链ＤＮＡ分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。冈此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。ＣｈｏａｎｄＫｉｍｌ２９１和Ｊ）－ｌ－ＪＰＣＲ－ｓｓｃＰ方法研究了生物降解十壤菲的过程中，细菌群体结构的动态变化，并借助计算机辅助作用很容易地对图谱进行比较分析。６）ＥＲＩＣ—ＰＣＲ图谱分析在肠道细菌中发现的ＥＲＩＣ序列是一段Ｋ为１２６ｂｐ的反向重复序列，定位丁．基闪纽内－Ｉ了转５微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选录的非编码区域或与转录有关的区域【＝ｌｏ】。后来证明这种序列在许多微生物中存在。以ＥＲＩＣ序列设计的特异引物对土壤中直接提取的总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，通过电泳分析其图谱，可以快速地用来比较土壤微生物的群落组成。ＥＲＩＣ．ＰＣＲ图谱分析和ＲＡＰＤ方法一样具有简便、快速的特点，可用丁比较不同士壤样品微生物结构的变化。但由于该方法不能反映七壤微生物系统发育方面的信息，所以无法对土壤微生物群落结构进行精细分析。７）变性梯度凝胶电泳ＤＧＧＥ和ＩＴＧＧＥ开始时在医学上用于检测基因突变，自］，）、ＭｙｕｚｅｒＩ３１１首先将ＤＧＧＥ技术应用到分子微生物生态学后，已证明这类电泳技术是揭示十壤中微生物群体遗传多样性的有效手段，现广泛用丁各种生境如水体【３２１、污染土壤㈣、及垃圾填埋场１３４１等中微生物群落结构及其种群动态变化监测。（１）ＤＧＧＥ厂ｒＧＧＥ的基本原理ＤＧＧＥ不是基于核酸分子量的不同将ＤＮＡ片段分开，而是根据序列的不同，将片段大小相同的ＤＮＡ序列分开。双链ＤＮＡ分子中Ａ、Ｔ碱基之间有２个氢键，而Ｇ、Ｃ碱基之间有３个氢键连接，因此Ａ、Ｔ碱基对对变性剂的耐受性要低于Ｇ、Ｃ碱基对。由于这四种碱基的组成ＩＮ．ｔ－Ｔｂ．列差异，使不同序列的双链ＤＮＡ分子具有不同的解链温度。当双链ＤＮＡ分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）或具有温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，冈其解链的速度和程度与其序列密切相关，所以当某一双链ＤＮＡ序列迁移剑变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链。部分解链的ＤＮＡ分子的迁移速度随解链程度增大而减小，从而使具有不同序列的ＤＮＡ片段滞留于凝胶的不同位置。结束电泳时，便形成相互分开的带谱。理论上认为，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电乐等足够精细，有一个碱基差异的ＤＮＡ片段都可被分开。用ＤＧＧＥ进行微生物生态研究时，为了使目的序列能够完全解链，在ＰＣＲ扩增目的片段时，会在某一引物的５’端人为掺入一段约４０个碱基的ＧＣ序列，称之为“ＧＣ帽”，用以调ｌＩ卜目的序列的解链行为。（２）ＤＧＧＥ的工作流程图ＤＧＧＥ分析微生物群落一般步骤如下：首先提取环境样品中微生物总基冈组ＤＮＡ并纯化，使之适合于对特定片段进＃７ＰＣＲ扩增，如扩增细菌Ｖ３区，Ｖ６～Ｖ８区，真核生物的ＩＴＳ间隔区等。然后通过电泳使扩增片段在变性梯度胶中分离，得到ＤＧＧＥ图谱。此时，可直接对图谱进行比较分析获得微生物种群变化的相关信息。也可将此图谱中条带切割卜．来进行序列测定，了解该环境样品中微生物群落的系统发育、种群构成等情况，＿并据此有目的的富集分离培养一些目标菌群。同时，还可将已测定序列标记为杂交探针，与环境样品原位杂交，以获得此生境中微生物种群的原始存在信息。ＤＧＧＥ扩增的片段为图１．１：６微生物学硕：｛二论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选ｎＩ＂■一可妪啪出ｋｍ她”Ｉ¨■＂Ｉ％Ｉ＂Ｉｗ■＂■啪■厂］Ｉ．．．．一Ｊ恒角区ｃ吲删”细Ｖ４．霓８—呵１ｌｊ４‰Ｖｈ６１￣１晒Ｖ２：１２ｌ￣２柏Ｖ３：４３６。．６００Ｖ允７３扣＂４Ｖ６，８剪－ｇ刀ＶＴ，９９０－１０彤Ｖ８ｌｌｌ８—１１∞Ｖ９：１２４０、１２孵ＶＩＯ１４１０￣ｌ卑口图１．１细菌１６ｓＲＮＡ片段示意图Ｆｉｇ１．１Ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ１６ｓＲＮＡｏｆｂａｃｔｅｒｉａＤＧＧＥ的上作流程图如下图１．２：图１．２ＤＧＧＥ的工作流程图Ｆｉｇ１．２ＴｈｅｆｌｏｗｄｉａｇｒａｍｏｆＤＧＧＥ（３）ＤＧＧＥ技术自身存在的缺陷ＤＧＧＥ作为一种分子生物技术，除了多数分子技术所Ｉ矧有的缺点，如在ＰＣＲ过程中产生的偏差等之外，其本身还有一些很难克服的缺点。首先，ＤＧＧＥ最多能分离ｌｋｂ的ＤＮＡ片段，但通常选用的片段只有儿百个碱基，冈此这些序列只能提供有限的系统发育信息【３５】；第二，如果选Ｈｊ的条件不是特别适宜，不能保证可以将有一定序列差异的ＤＮＡ片段完全分开，从而会出现序列不同的ＤＮＡ迁移到胶的同一位置１３６】；第三，有些细菌具有多操纵子，ＤＧＧＥ能将其在ＰＣＲ时形成的不同序列分离开，这样就可能导致过高的估计环境中的微生物多样性ｐ７ｌ；第四，ＤＧＧＥ只能检测剑一定数鼙的微生物的存在，通常只能检测到环境中优坍菌群的７微生物学硕十论文无氯酚对土壤微乍物区系影响及其降解菌的筛选存在（３引。通常只有占整个群落细菌数量约１％或以上的类群能够通过ＤＧＧＥ检测到。８）宏基冈组（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）的测序近几年，宏基因组文库已逐渐成为研究土壤微生物多样性义一个重要的丁具。它可提供大量难培养和不可培养微生物的基因信息，这些信息是进行环境中难培养微生物的系统发育研究和功能研究所必需的【３９】。Ｍｉｃｈｅｌｌｅ等人利ＨｊＢＡＣ载体构建两个土壤微生物宏基冈组文库【４０１，共获得超过１Ｇｂｐ的ＤＮＡ分子，通过对１６ｓＲＮＡ序列的分析发现，ＢＡＣ文库中包括，低Ｇ＋ｃ％，革兰氏阳性的Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｅｓ，Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ等多种微生物。由丁微生物在环境样品中的含量低，且环境样品中通常含有大量影响对ＤＮＡ进行分子操作的物质，有效地纯化环境样品中得到ＤＮＡ是该方法的关键。目前土壤微生物ＤＮＡ多样性研究多局限丁原核生物，而对真核生物研究不足。另一方面，上述技术分析成本高、费时，实验条件要求高，而且在微生物的种类鉴别与定量分析方面也存在一定的局限性。由丁在土壤微生物总ＤＮＡ提取过程中，腐殖质干扰人，ＤＮＡ容易断裂和降解，容易使ＰＣＲ扩增失败或呈假阳性；而且土壤中有些细菌很难裂解，大多数ＤＮＡ纯化方法仅适宜特定的土壤，不能通用丁各种土壤，这些问题均有待解决。，随着方法的不断完善，它将使土壤微生物多样性研究逐步从黑箱研究进入到白箱研究阶段，使十壤微生物多样性在微观研究上深入到分子水平。１．４关于ＰＣＰ１．４．１ＰＣＰ的物理和化学性质ＰＣＰ的化学式为Ｃ６Ｃ１５０Ｈ，结构式如图１．３，纯的ＰＣＰ为无色结品，一般农药用的ＰＣＰ通常含有２，４．二氯酚，２，３，４．三氯酚，２，３，５，６一四氯杂质，颜色呈灰暗色到棕色，以薄片或者粉粒的形式存在。纯ＰＣＰ的熔点为１９０＂Ｃ，沸点为３１０＇Ｃ。分子量为２６６．４，密度为１．９８７＊１０３Ｋｇ．ｍ一。常用的溶剂有甲醇、乙醚、二氯甲烷、正己烷、稀碱、热的苯液，ＰＣＰ在水中的溶解度受溶液中ｐＨ变化的影响很大。ｐＨ升高，溶解度增大。冈为ＰＣＰ是一种在水图１．３ＰＣＰ的分子结构式Ｆｉ２．Ｉ．３ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰＣＰ８微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选中可解离的弱酸性有机化合物，在水中可解离为离子态ＰＣＰ。随ｐＨ升高，离子态ＰＣＰ浓度增大，使ＰＣＰ在水中总溶解度增大１４１１。１．４．２ＰＣＰ的使用和污染现状ＰＣＰ是一种氯代芳香族化合物，发现于１８４１年，到１９３１年才开始投入上业生产，主要用作防腐剂。１９５２年日本用ＰＣＰ的钠盐杀灭血吸虫中间寄主钉螺，同时还发现它有良好的除草效果，从此这种化合物被广泛片ｊ丁工农业生产中。上业上常用作防腐剂如木材、皮革的防腐；农业上片ｊ作杀菌剂、除草剂、杀真菌荆；医疗卫生上用作杀虫剂、杀白蚁剂、消毒剂、杀灭钉螺等。１９８５年，全世界ＰＣＰ的产量达到１０万吨，当时我国ＰＣＰ及其钠盐的年产量接近１万吨相当于全世界总产量的１０％１４２１。由ｔ－－ＰＣＰ杀灭血吸虫中间宿主．钉螺的效果显著，我国从５０年代起，ＰＣＰ就作为血吸虫病疫区的常用药物，在长江中下游１１个省、市、自治区大面积的范围内长期大量地使用。目前我国血吸虫疫区己经停止施用ＰＣＰ钠，但以往施用的ＰＣＰ钠对环境的影响还会持续很长的时间。张兵，郑明辉等２００１年对洞庭湖水和底泥中的ＰＣＰ含量进行测定后发现，有的断面水和底泥中ＰＣＰ的含量竞高达１０３．７ｌａｇ－Ｌ一和４８．３ｌａｇ・百１十污泥【４川。干宏等对海河流域儿种典型优先控制有机污染物的环境安全性分析时发现，ＰＣＰ的环境实测浓度值已经是无影响浓度值的８．０４倍…。世界上其它地方ＰＣＰ的污染现状也不容乐观，１９９４年Ｔｈｏｍｐｓｏｎ报道了加拿人的Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ地区，在非职业暴露人群中，尿中所含有的ＰＣＰ的浓度平均达到１．６ｌａｇ．Ｌ．１，最低含量也超过０．２ｌａｇ．Ｌ。１【４５】。Ａ．Ｊ．Ｃｅｓｓｎａ等人调查了加拿大－Ｚｇｂ三个地区空气ｑｂＰＣＰ的含量后发现：其中有两个地区空气ｑｂＰＣＰ的平均含量为０．３ｎｇ．ｍ一，在另外一个地区ＰＣＰ的平均含量为１．５３ｎｇ．ｍ－３１４６］。１．４－３ＰＣＰ对生物的毒性作用毒理学研究表明，ＰＣＰ能使细胞膜对质子的通透性增加，阻断氧化磷酸化作用，从而导致跨膜ｐＨ梯度和电势的丧失【４¨。哺乳动物的皮肤对ＰＣＰ有吸收作用，能从土壤中等环境介质直接吸收ＰＣＰ，ＰＣＰ能使皮肤腐蚀，引起灼伤和水泡。哺乳动物人量接触ＰＣＰ会引起体温升高、呼吸频率加快、血压升高和高血糖症以及心血管紧张等疾病１４７１。ＰＣＰ被怀疑是一种强致癌因子或致畸冈子，为一种诱变剂或辅诱变剂。在微宁宙和现场实验中发现，ＰＣＰ除了对土壤生物有直接毒害作用外，它还可以间接地影响土壤的ｐＨ值和有机十层中水的含量，从而改变土壤的生态环境，影响生物的正常生活规律１４８１。在ＰＣＰ对微生物生长速度的影响方面，当ＰＣＰ的浓度在抑制范嗣之下时，微生物的生长速度会与ＰＣＰ浓度成正比；但当ＰＣＰ浓度超过基质抑制浓度时，微生物的生长速度就会受到抑制而逐渐减慢【４９１。毒性基质对微生物的伤害可用ＥＣ５０来表示。（ＥＣ５０表示微生物所能忍受的毒性基质浓度的上限，在这一浓度时，将有一半的微生物会被有毒基质杀死）。不过，ＥＣ５。是一个条ｆｔ：值，不同的微生物种群由丁．驯化的科度不同其ＥＣ５０值不同ｐⅢ。ＰａｌｖｌＭ．Ｍ等人分别研究了多种不同氯酚类化合物对微生物的毒性影响后发现，氯化程度越高的氯酚其ＥＣ５０越低对微生物所产生的毒性越强，故本试验所研究的ＰＣＰ足酚类化合物中毒性最强的１ｓ１１。９微生物学硕十论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选１．４．４ＰＣＰ的吸附特性有机化学物质的吸附性能直接影响他们在土壤中的滞留、挥发、生物降解、运输及其在生物体中的积累。有机质是有机化学物质的主要吸附剂，特别是对于一些疏水化合物。ＰＣＰ是一种弱酸（ｐＫａ＝４．７５），其中性分子具有强烈的厌水性，因此，在有机质含量高的悬浮物和沉积物上的吸附较大。ＰＣＰ在己烷中的溶解度相当高，可以准确的测定吸附前后的浓度变化。ＰＣＰ的吸附是由于酚羟基上的负电荷与土壤颗粒表面电荷之间的相互吸引产生的。地表水和地。Ｆ水体系中的ＰＣＰ都可发生强烈的吸附。当ＰＣＰ浓度超过其溶解度时，会在粘土颗粒上形成沉淀。在阳离子交换量（ＣａｔｉｏｎＥｘｃｈａｎｇｅＣａｐａｃｉｔｙ，ＣＥＣ），有机碳比例，粘粒含奄，水土比及ｐＨ等五个影响冈素中，ｐＨ对ＰＣＰ吸附的影响最为明显１５２１。ｐＨ对ＰＣＰ在＿十壤上的吸附大小有决定作用，ｐＨｄ、于７时，冈为酸性土壤溶液能够给ＰＣＰ提供质子，从而增强了ＰＣＰ吸附：而当ｐＨ大于７时，以阴离子形态存在的ｐｃｐｒ）ｌｊＪ以离子对的形式被吸附。实际上，ＰＣＰ只有在酸性条件下才在土壤上有显著地吸附，且吸附容量正比于土壤的有机质含量。无论ｐＨ怎样变化，ＰＣＰ的吸附都随着十壤中有机质含量的增加而增加１５３｜。１．４．５ＰＣＰ降解的研究现状关于农药在陆生生态系统，特别是农田生态系统中环境行为的研究远远滞后于水生生态系统。近年来，同绕降毒去污探索高效廉价污染十壤清洁技术成为国内外研究的热点。十壤是多介质多过程的复杂体系，具有纳污和净污双重功能，虽然有机污染物种类繁多、毒性与降解程度各异，但通过调控使十壤中物理、化学及生物（专性微生物与植物）等过程协同偶联起来，可大大加强其净化功能，达到高效廉价降毒去污的日的。对氯代有机物的治理大致可归纳为：物理法、化学法、生物法。１．４．５．１ＰＣＰ的光降解研究状况尽管非解离酚的最人吸收波长入ｍａｘ＝２７０ａｍ，但如与金属原子配合成为阴离子，入ｍａｘ可超过３１０ａｍ，冈此，酚阴离子容易发生光降解作用，而：１仁解离的酚也可借助于光敏剂的能量转移作用而发生光降解。化合物的酸性越强，其解离常数越人，越容易生成阴离子，而酚阴离子对３１０ｒｉｍ以上的光（太阳光谱）吸收强，所以酚转变成为阴离子时使其易发生光降解。关于ＰＣＰ光降解的研究都是在水相中进行的。在ｐＨ３．０５Ｉ戈５．０㈣＇Ｆｅ３＋或含Ｆｅ３＋＋腐殖酸的溶液中，ＰＣＰ与铁形成复合物，能促进ＰＣＰ的光降解。复合物的浓度随ｐＨ的升高而增加。入＞３７０ｎｍ，照射８ｈ可使２０—４０％的ＰＣＰ发生降解，也有脱氯反应发生。在只含有Ｆｅ”的条件Ｆ，ＰＣＰ降解的中间产物通过基团偶联形成二聚合物２ＨＮＣＰ（２一ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎａｃｈｌｏｒｏｄｉｐｈｅｎｙｌ土壤中ＰＣＰ的光降解一般指发生在十壤表面与光线接触的部位，所以作用并不大。多数ｅｔｈｅｒ）和ＯＣＤＤ（ｏｃｔａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ－ｐ—ｄｉｏｘｉｎｅ）。而在含Ｆｅ３＋＋腐殖酸的条件下，可能是因为ＰＣＰ降解中间产物与腐殖酸能通过共价结合，阻止了ＰＣＰ降解中间产物的二聚和，冈而没有２ＨＮＣＰ乖ＩＩＯＣＤＤ的形成ｐ引。Ｋｏｓｈｉｏｋａ等Ｈｊ氛灯照射３３ｍｉｎ，溶于正己烷中的１００ｐｐｍｆｌ勺ＰＣＰ在２９２．１ｎｍ降解速率最人，１０ｐｐｍ的ＰＣＰ在２５２．６．３１８．６ｎｍｔＥｔ降解速率最人ｆ５５】。在降解过程１０微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选中，ＰＣＰ可发生脱氯反应，部分氯原子还与溶剂发生基团取代反应。Ｌｉｕ等在研究十壤表面ＰＣＰ光解过程中ＰＣＰＤｓ的形成时发现，ｐＨ越高，ＰＣＰ的ＵＶ光解生成的二恶英越少，可能是在高ｐＨ条件下，ＰＣＰ以金属酚盐的形式结合丁土壤上，使得ＵＶ难以发挥作用１５引。１．４．５．２ＰＣＰ的物理化学降解研究状况以往对ＰＣＰｔＥ生物降解的研究包括臭氧降解，Ｆｅｎｔｏｎ试剂降解，紫外光降解，超声降解，电解，超临界水氧化以及脱氯降解等【５７１，但是没有一种方法是可以广泛加以推广的。此外，在温和的条件下，如中性ｐＨ，室温常压，非真空，没有昂贵的试剂和特殊反应装置等条件下，ＰＣＰ完全降解还鲜见报道。但是部分氯酚在灭菌的Ｓｉ０２沙粒上能进行迅速的１Ｆ生物降解，以及在灭菌好气、灭菌厌气培养的土壤上对氯酚的研究表明，非生物降解对于土壤中部分酚类的清除起到了很大的作用。上壤中氯酚的化学转化可以归因于自氧化，铁锰氧化物的氧化以及粘土矿物表面的氧化，并最终形成有色复合物（ｃｏｌｏｒｅｄｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）或不可逆的结合于有机质上。氯酚通过酶反应的氧化降解是氯酚的自然修复过程，但是高氯代化合物如ＰＣＰ即使在很低的浓度下，也很难被生物降解。过氧自由基对氯代酚的降解有重要的作用，向溶液中加入Ｆｅ（ＩｌＩ）和腐殖酸可以通过Ｐｈｏｔｏ．Ｆｅｎｔｏｎ反应生成羟自由基，对于有机物质米说，羟自由基是很强的氧化剂，对水体和土壤中有毒化学物质的降解有重要的作用。通过ＤａｒｋＦｅｎｔｏｎＲｅａｃｔｉｏｎ研究助溶剂对ＰＣＰ去除效率的影响发现，在仅有腐殖酸存在的条件一ＦＰＣＰ的去除并不是羟自由基的作用，而是受到氯代苯氧类物质生成的过氧自由基的攻击。在仅有铁（１ＩＩ）存在的条件下，光照去除ＰＣＰ与经自由基有关，铁（ＩＩＩ）一羟基复合物降解释放羟自由基是酸性溶液中发生的重要反应。冈此在ｐＨ３，仅有铁（ＩＩＩ）存在时，ＰＣＰ的去除与羟自由基有关。ＰＣＰ的光降解与ＰＣＰ．铁（ＩＩＩ）矛ＩＩＰＣＰ．铁（１１１）．腐殖酸的浓度有关，且复合物的浓度随ｐＨ的升高而升高。但实际上ＰＣＰ的降解是在ｐＨ３时得到了促进而不是ｐＨ５。冈为过氧化氢是腐殖酸光激化产生的活性中间产物，而羟自由基是过氧化氢与铁（１ｉｄ反应生成的。也就是说，通过Ｐｈｏｔｏ．Ｆｅｎｔｏｎ反应去除ＰＣＰ需要有大量的铁（ＩＩ）的存在。此外，铁Ｏｉｌ）被腐殖酸光还原是在酸性条件下得到促进的，因此酸性条件下ＰＣＰ的有效去除应归功丁铁（ＩＩＩ）的光还原。Ｂｒｉｌｌａｓ等１５８Ｊ也发现ＰＣＰ．铁（１１１）复合物的Ｄａｒｋ—Ｅｌｅｃｔｒｏ．Ｆｅｎｔｏｎ降解的速度要慢于Ｐｈｏｔｏ—Ｅｌｅｃｔｒｏ—Ｆｅｎｔｏｎ反应。这说明在仅有铁（１１１）存在的体系中，ＰＣＰ的氧化降解是铁（ＩＩＩ）的光还原造成的，而在铁（ＩＩＩ）和腐殖酸共存条件下，ＰＣＰ的氧化降解是由丁－光导致的Ｆｅｎｔｏｎ反应造成的。高级氧化过程（ＡｄｖａｎｃｅｄＯｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ＡＯＰｓ）是以目前应用于去除有机污染物的羟自由基化学为基础的，羟自由基以一种非选择性的方式与有机污染物进行反应，并最终将其矿化。有关ＰＣＰ的自由基降解己有一定的研究，如Ｆｅｎｔｏｎ反应，直接光化学降解，过氧化氧的光降解，Ｆｅｎｔｏｎ试剂辅助的光化。学降解，以Ｔｉ０２作为催化荆的光催化降解及声化学降解等，但多数都足以水体系为研究对象。直接光化学降解是一个非常。ｔ曼ｆｌ，＇Ｊ过程，辅助光化学降解（如过氧化氢的黼ｌｌＦｅｎｔｏｎ试剂）则需要向待处理的污染体系添加一些化学物质（如ＴｉＯ！），光催微生物学硕＋论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选化降解是一种很有效的过程，但是在处理结束后必须除去添加的Ｔｉ０２颗粒。冈此，以电化学引起的高级氧化过程开始引起人们的重视，它以Ｆｅｎｔｏｎ试剂生成羟自由基为基础，Ｈ２０２＋Ｆｅｐ—Ｆｅ”＋ＯＨ＋ｏＨ。，但高级氧化过科中的自由基是通过电化学反应在原位生成的，它与Ｐｈｏｔｏ。Ｆｅｎｔｏｎ过程类似，因此这个过程被称为Ｅｌｅｃｔｒｏ．Ｆｅｎｔｏｎ。电化学引起的高级氧化作用已成功的应用于氧代酚氧乙酸类农药如２，４．Ｄ，２，４－ＤＰ，ＣＰＭＰ，２，４，５－Ｔ以及硝基酚等的净化。Ｏｔｕｒａｎｅｔａｌｌ５９】发现，在反应过程中，当ＰＣＰ及其衍生物已完全消失后，仍然不断有氯离子释放出来，说明芳环打开后生成的脂肪族化合物上的氯原子也在不断的释放出米。ＰＣＰ通过矿化降解的速度明显的低于２，４－Ｄ，ｌｌｐ．硝基酚，这可能是冈为在ＰＣＰ的苯环上，所有的位置都已被取代，羟自由基难以找到适合的位置进行攻击，冈为羟自由基加成到已被其他取代基占据的位置要难于未被取代基占据的位置。Ｅｌｅｃｔｒｏ．Ｆｅｎｔｏｎ过程可以有效的、无选择性的矿化有机污染物，如２６ｐｐｍＰＣＰ经过Ｅｌｅｃｔｒｏ．Ｆｅｎｔｏｎ过程处理，可使其浓度降低到Ｏ．５ｐｐｍ以下。从生态和经济的角度讲，原位电化学催化生成Ｆｅｎｔｏｎ试剂的方法要显著的优丁Ｐｈｏｔｏ．Ｆｅｎｔｏｎ和Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｆｅｎｔｏｎ过程。催化加氢脱氯是将有毒有害物质在密闭的体系内转化为可再利用的物质。这一技术目前还在探索阶段，但是在液相和气相中以氯苯和氯酚作为典型反应物，以把、铂和镍为催化剂的研究已有报道【６们。研究表明，在以亲电机制完成的脱卤过程中，当苯环上的取代基为电子给体时会加快整个反应的速度。氯代有机污染物的还原脱氯也是研究较多的降解方法，零价金属还原脱氯有很多优点，如费用低，没有多氯二苯并二恶英（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎｓ，ＰＣＤＤｓ）年１１多氯二苯并吠喃（Ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ．ｆｕｒａｎｓ，ＰＣＤＦｓ）等反应产物。Ｍｏｒａｌｅｓ等｜６ｌＪ研究发现以Ｐｄ作为催化ｊｆｔＪＭｇｕ－Ｊ使体系中的ＰＣＰ彻底清除，且反应产物只有环己醇和环己酮。在土壤的蓄水层中，有机氯代化合物女ｌｌＰＣＰ对十壤基质强烈的亲和力降低了传统的ＰｕｍｐａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ的修复效率。蒸汽注入法（ＳｔｅａｍＩｎｉｅｃｔｉｏｎ）是通过注入水蒸气，使地Ｉ－ｎｋｍｇ．Ｌ～，４６．８的温度升高从而增加了ＰＣＰ在水中的溶解度。２５．１℃时ＰＣＰ的溶解度为２１．４十１℃时ＰＣＰ的溶解度为８６．２士１ｍｇ．ＬＪ【６２１。温度升高时，ＰＣＰ更倾向于水相而不是土壤，当水蒸气注入到含水土层中时，ＰＣＰ更易玄除。提高十壤温度的途径，如电极加热、注入热水、注入水蒸气等都有益于提高ＰｕｍｐａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔ修复手段的效率。利用水蒸气去除挥发性有机物的实验已有一些报道，但是通过加热去除半挥发性有机物（ｊｔｌＪＰＣＰ）的研究则几乎没有。在台湾的台南，目前正在研究向蓄水层注入热水加热土壤基质这一看起来很有前景的修复手段的可行性。１．４．５．３ＰＣＰ的生物降解研究状况Ａｕｇｕｓｔｉｎ等１６３Ｊ指出在十壤环境中ＰＣＰ是中等持久性有机污染物，田间的半衰期为４５天。ＰＣＰＣｔ‘Ｊ降解土要是通过厌氧生物降解。在水环境中，ＰＣＰ主要结合丁．沉积物或水中飘浮的颗粒物上，生物降解主要发生在沉积物或颗粒物的表面，此时，ＰｃＰ的半衰期为几小时．儿天畔Ｊ。ＰＣＰ微牛物降解的代谢途径是首先水解生成２，３，５，６．四氯代氢醌（２，３，５，１２微生物学硕士论文五氯酚对ｊｌ：壤微生物区系影响及其降解菌的筛选６－ｔｅｔｒａｃｈＬｏｒｏｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｎｅ），继而是一系列的脱氯步骤，然后生成３．ｏｘｏａｄｉｐｉｃａｃｉｄ，最后分斛Ｊ０ｃ０２和Ｃｌ‘１６５１。循嫩廿酗十服撒佣¨引求］Ⅺａ一焱一Ａ潞ａ一冉Ｑ一冉Ｑ０１－Ｉ．Ｏ．ＨＯＨ伽－。阳－ｔ＂埘ＱＩａａＱｃＩ！．ＱａⅡ．她一一旷壬姐．ｊ｝ＬＨａ我ＯＵ佣０１１峨吼一＋饵人Ｕ一伽文五氯酚的有氧降解途径图１．４五氯酚的降解途径五氯酚的厌氧降解途径Ｆｉｇ．１．４ＴｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｏｆＰＣＰＬｉｕ等１６６】却认为ＰＣＰ在有氧条件下能降解到可以忽略的程度，而在厌氧条件下几乎没有降解。多为厌氧条件的河湖底泥中ＰＣＰ的含量通常很高可能与此有关。Ｂｏｙｌｅ－等１６７１也认为与ＰＣＰ持久性有关的二个环境因素为：１）缺少光照和土壤含水量低；２）ｐＨ接近或低－ｊ－．ＰＣＰ的ｐＫａ值；３）低０２浓度。自然环境中ＰＣＰ的降解产物五氯苯甲醚只在有通风透光的样品中存在，说明光照和好气微生物群是形成这一降解产物的必须条件，冈此认为ＰＣＰ在缺氧的湖泊均温层可能是最稳定持久的。Ｂａｋｅｒ币ｌｌＭａｙｆｉｅｌｄｌ６８】的研究结果表明好气微生物对各种酚的降解速度快慢不等，但在厌气条件下，所有的氯代酚类都没被厌气培养的土壤微生物降解。同时灭菌实验发现非生物降解对于土壤中氯代酚类的降解起到了很大的作用。Ｉｄｅ等１６９ｌ则认为ＰＣＰ在好气和厌气条件下都可发生降解和转化，好气条件卜－，ＰＣＰ转化首先生成五氯苯甲醚，但是３０天后这两种物质的７５％都已消欠。厌气条件下ＰＣＰ还原脱氯生成二、三、四氯酚的混合物。脱氯的速度与电子供体（全碳、全氮、有机氮的矿化速率）的供给和微生物量密切相关，例如酵母提取物能促进ＰＣＰ的降解，而（ＮＨ４）２Ｓ０４，ＮＨ４Ｎ０３，尿素没有影响。向有机质和微生物量含量低的十壤中加入蛋白质电子供体也可以促进ＰＣＰ的还原脱氯。在水稻土中，脱氯是ＰＣＰ降解的主要途径，且微生物所起到的作用大于十壤的其它化学冈素。Ｚｅｌｌｅｓ等１７０】认为ＰＣＰ的还原主要是通过生物矿化成ＣＯ，。ＰＣＰ的脱氯过程在硫酸盐还原和甲烷生成的条件下受到促进，而在反硝化条件下受到抑制。在上述三种相同的条件下，加入乳酸盐、丙酮酸盐和醋酸盐等能促进ＰＣＰ的脱氯，加入锰氧化物能减缓脱氯的速度，而加入ＦｅＣｌ３Ｉ）ｌｌＪ抑制脱氯。十壤中加入乳酸盐可导致甲烷的人量生成，锰氧化物次之，而ＦｅＣｌ３的促进作刚最小ｆ７１１，因此认为产甲烷条件下，ＰＣＰｆｌＯ微生物降解受剑促进。｛＿ＯＤｅｌａｕｎｅｅ等１７２１的实验表明ＰＣＰ的降解速率随ｏ．Ｒ势的降低而降低。Ｗａｔａｎａｂｅｌ７３１通过田间施州ＰＣＰ研究它的降解菌和耐性菌。在ＰＣＰ施用后最初的６周，＋壤中微生物增加了３个数昔级，且增加的数量能保持剑第二年春天。与术施）ｔＪｐｃｐｆｌ：Ｊｔ－．壤相１３微生物学硕士论文五氯酚对＿ｆ：壤微生物区系影响及其降解芮的筛选比，施ＨｊＰＣＰ的土壤中并没有甯集更多的氯酚降解菌，但能导致耐ＰＣＰ的菌种在短时间内（２周）大量繁殖。但是Ｍａｎｎｉｓｔｏ等｜７４Ｊ在对芬兰地下水的研究中并没有发现氯酚污染对微生物数量的明显影响。并从污染水中分离出１６个革兰氏阴性和一个革兰氏阳性的多氯酚降解菌簇（ｃｌｕｓｔｅｒｓ），得到了７个降解ＴｅＣＰ年１１ＰＣＰ的革兰氏阳性降解菌。从污染水源中分离得到的氯酚降解菌，其脂肪酸模式（ｐａｔｅｍｓ）的多样性说明了降解菌种类的多样性。研究结果表明，氯酚长期污染的结果导致地卜．水中厌氧微生物群体的大量生成，氯酚降解茵的多样性表明污染的地卜．水中广泛分布着氯酚的降解菌，但是地卜水中污染物浓度的长期稳定性说明体系本身固有的修复功能的开始要通过对环境条件的调控得以实现。Ｓｍｉｔｈ＠ｌＮｏｖａｋ【７５Ｊ研究了亚表层土壤中几种氯代酚的生物降解，发现降解速率随氯代酚起始浓度的增加而增加，土壤特性对降解有一定的影响。在饱和与未饱和的Ⅱ表层土壤中，微生物降解是酚与其氯代衍生物的重要清除机制。另外也可以采用堆肥通过微生物降解对氯代酚类化合物污染的土壤进行生物修复，一段时间后，除了主要的二聚体污染物多氯苯氧酚外，所有的氯代酚类都降解了。研究表明，灭菌的污染十壤用几种氯酚的矿化剂或堆肥中的天然微生物培养后，氯酚的降解速率更快。在堆肥中，与微生物降解相比较，氯酚的甲基化就不很重要了。土壤中ＰＣＰ的活性和毒性很大程度上受十壤中微生物群活性的影响。ＰＣＰ在成熟水稻土中的降解速度快，而在新曝地或未成熟水稻土中的降解速度慢，说明ＰＣＰ的降解与土壤中的微生物活性密切相关。在自然土壤中也广泛存在着降解ＰＣＰ的微生物，人为改变环境条件可以提高其活性。用ＰＣＰ处理过的十壤中富含能降解ＰＣＰ的微生物，因此，曾施用过ＰＣＰ的上壤对再次加入的ＰＣＰ的降解速率要高于未曾施用ＰＣＰ的十壤。降解ＰＣＰ的微生物在土壤风干后仍能存活，当环境适宜时，能非常活跃的降解ＰＣＰ。此外，直接向十壤中加入一定量的能利用ＰＣＰ的微生物，也可显著缩短ＰＣＰ的半衰期。氯酚可以通过酪氨酸酶、过氧化物酶和漆酶等氧化还原酶催化的腐殖化作用，结合到士壤的有机质中。Ｄｅｃ矛ｌｑＢｏｌｌａｙｌ７６ｌ等人通过实验测定出辣根过氧化物酶催化ＰＣＰ的最佳ｐＨ为５．３。纯化的漆酶在２４ｈ内能将２５ｐｐｍ的ＰＣＰ１００％的降解，对２００ｐｐｍ的ＰＣＰ能降解４０％ｌ７７】。锰过氧化物酶也能降解ＰＣＰ，但是降解效率远低丁漆酶，４８ｈ对５０ｐｐｍ的ＰＣＰ只能降解１５％，１００ｐｐｍ的ＰＣＰ只能降解１０％。但是锰过氧化物酶和漆酶的结合并不能提高对ＰＣＰ的降解速率。在Ｃ．Ｖ．培养基上漆酶的活性占主要地位，冈此可以用ＣｏｒｆＤｌｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ同体培养基完全除去溶液中的ＰＣＰ。在小麦壳培养基上培养：至ｌＪ４周时，漆酶的活性最高，能将２００ｐｐｍ的ＰＣＰ全部除去。部分ＰＣＰ还可结合于小麦壳上或真菌的菌丝上。ｌｔｏｈ犁７剐在研究酚酸对漆酶降解ＰＣＰ的影响时发现，在邻（ｏｎｈｏ）对（ｐａｒａ）何上有氯原子的酚对漆酶更敏感一些，随着氯原予数目的增加，反应也有所加强，而间位（ｍｅｔａ）上的氯原子降低了反应的活性。漆酶在降解２，４一－二氯酚的过程中，芥子酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃａｃｉｄ）要ＬＬ２，４一二氯酚更易与漆酶反应，冈此在培养初期会对降解产生竞争抑制作用，但是随着反应的进行其反应产物可促进漆酶对２，４．二：氯酚的降解，而阿魏酸（ｆｅｒｕｌｉｃａｃｉｄ，ＦＡ）白始至终都住抑制漆酶对２，４．二氯酚的降解，可能足冈１４微生物。≯硕十论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选为ＦＡ的反应产物（女ＩＩＦＡ苯氧自由基）可使漆酶失活造成的。Ｋｌｉｂａｎｏｖｌ７９ｌ等人最一ｙ－采用过氧化物酶去除废水中的酚类和芳香胺类化合物，并将其用丁二含酚废水的脱色。该酶在Ｈ２０２存在的情况下可氧化多种酚类，产生相应的自由基，自由基发生聚合反应生成难溶丁水的人分子物质。这一反应被称为氧化耦合。不溶丁水的高分子物质从水中沉降出来，可以通过简单的过滤和絮凝从水中彻底玄除。与化学催化不同的是，Ｈ２０２浓度超过一定量时，去除率呈下降趋势，开始出现底物抑制现象，因此Ｈ２０２投加量存在一个最佳值。对辣根过氧化物酶催化酚类的效率随酶浓度降低而下降的原冈曾提出过两种假设：１）当Ｈ２０２／酶比例较高时，Ｈ２０２是酶活性的抑制剂，因此增加酶浓度会减小这个比例，消除抑制，提高底物的去除效率；２）Ｈ２０２被一个与酶催化主反应无关的旁路反应所消耗，该旁路反应与Ｈ２０２的亲和力小于酶催化反应与Ｈ２０２的亲和力，冈而提高酶浓度可以通过增加Ｈ２０２与酶的反应而使去除率上升。现己知水体沉积物、城市污水厌氧消化污泥、产甲烷富集培养物对ＰＣＰ具有还原脱氯活性，可形成低氯代苯酚或完全矿化形成Ｃ０２，ＣＨ４，Ｈ２０币ＩｌＨＣＩ。它们的还原脱氯活性及氯酚降解历程受接种物、驯化物、驯化时间、电子供体和电子受体的影响。在对白腐真菌的研究中发现，过氧化物酶对木质素和酚类物质的降解起到了很人的作用，并引起了广泛的关注１８０｜ｏ自腐真菌是降解氯代酚类最有效的真菌之一，它主要通过分泌漆酶、多酚氧化酶、锰’过氧化物酶等对培养基中的ＰＣＰ进行生物降解。过氧化物酶参与ＰＣＰ平ｌｌ其他氯代酚的生物降解是一个有争议的结论。Ｍｕｒａｎｄｉ等１８ｌＪ通过对火量真菌的研究并没有发现ＰＣＰ降解与过氧化物酶之间有很好的相关性。Ｇｕｉｒａｕｄ等【８２】在污染＿十壤中分离得到的Ａｆｕｓｃａ（接合菌），虽然降解ＰＣＰ的效果很好，但是并没有检测剑过氧化物酶的活性。除了研究较多的担子菌和白腐真菌外，其他类别的真菌也能对各种污染物进行降解，从而实现对污染土壤，沉积物和水体修复。土壤中的真菌可以非常有效地对土壤中的污染物进行生物降解，但是有些真菌却对污染物特异的敏感，冈此这类真菌可用来作为指示生物１８２】。土壤中的微生物对高浓度化学物质的抵抗能力是不同的，有些微生物对污染物特别敏感，在高浓度的污染物或低碳，低能量的环境中难以生存，而有些微生物在这样的环境中则能够很好的生存，后者通常有特异的基因编码酶系统可以代谢或至少可以转化污染物。研究发现，被ＰＣＰ污染的土壤能诱导产生ＰＣＰｆｌｏＪ矿化菌Ｓ．ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｓｔｒａｉｎＲＡ２，但是这种细菌在没有ＰＣＰ的土壤中不能存活。此外，假单胞杆菌也是研究的较多的一类降解氯代酚类的细菌。表面活性剂可以通过提高污染物的水溶解度而促进环境中厌水有机污染物的生物降解。Ｔｏｂｉａ等１８３】通过对木材加上厂附近ＰＣＰ污染土壤的小规模洗涤实验表明，１卜离子和阴离子表面活性荆可以促进ＰＣＰ从污染的十壤上解吸下来。表面活性剂抑制污染物的降解也有报道，可能是由丁表面活性剂分子与细胞膜的相互作州改变了脂膜的流动性，或表面活性剂分子直接与脂膜上的结合蛋白作用。表面活性剂也可以通过与酶结合或与底物结合直接实现抑制作刚，而污染物生物降解的降低就是由丁二底物分子结合到了表面活性剂的粒子中的缘故。有表１５微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选面活性剂存在的条件下，ＰＣＰ的溶解度依赖于解离态的酚（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｈｅｎ０１）和非解离态酚盐（ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｈｅｎｏｌａｔｅ）的溶解度以及这两种粒子在表面活性剂中的分配状况。Ｃｏｌｔ等凹ｌ的研究表明，非离子表面活性剂，ＴＮＰｌ０并没有表现出通过普遍认为的细胞毒性机理抑￥１］ＰＣＰ的生物降解。在低浓度的ＰＣＰ环境中，ＴＮＰＩＯ抑制了ＰＣＰ的生物降解是因为部分ＰＣＰ进入剑ＴＮＰｌ０的粒子内，使微生物难以利用，而在高浓度的ＰＣＰ条件下，ＴＮＰｌ０促进了ＰＣＰ的降解是因为一部分ＰＣＰ进入到ｎ岬１０粒子内，降低了溶液中ＰＣＰ的浓度，即降低了高浓度ＰＣＰ对微生物的毒害作用，从而有利于ＰＣＰ的生物降解。１６微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选２不同浓度ＰＣＰ对土壤微生物区系的影响农药在农业生产中的作用是不容置疑的，从不使用农药的自然农业发展剑使用农药的现代农业，农药作出了积极的贡献。但是随着使用范同不断扩大，大量有毒物质进入土壤、水体、大气及生物体内，通过生物富集和食物链造成了生物体内的残留，造成一系列诸如环境污染日趋严重、农副产品中有毒物质残留人人超标和各种疾病增多等的公害问题，严重危害了人类的健康和破坏生态平衡。近几十年来，农药与土壤微生物的生态关系成为污染生态学活跃的研究领域之一陋８６。８７１。农药本来是针对某些特定的有害生物而生产的，有一定的选择性，但绝对专一性的农药实际上并不存在。农药一方面对提高农作物产量起了非常重要的作用，但另一方面由丁有毒物质残残毒引发的环境污染大大促进了对其安全性及其在环境中（特别是土壤环境中）动态和生态效应的研究。ＰＣＰ作为一种有毒有害有机物，已被许多国家列入优先污染物ｆ８引。其钠盐曾被Ｊ“泛应用于木材、皮革的防腐，杀菌，除草，杀虫，消毒，杀灭钉螺等【４３１。在土壤中的残留量很大，给环境造成了严重的危害。因此研究ＰＣＰ与十壤微生物的生态关系对了解ＰＣＰ在环境中的代谢迁移以及研究ＰＣＰ的生物降解都有重要的意义。土壤中的微生物可以分为可培养的微生物和不可培养微生物，越来越多的证据表明，可培养微生物仅占自然环境微生物的极少部分。Ａｍａｎｎ【１ｌ】等认为，自然环境中尚不可纯培养的微生物高达８５％．９９．９％，并且即便是得到了纯培养，在不同的培养条件下其形态和生理特征均可能发生很多变化。这成为全面客观认识自然环境中微生物群落的严重障碍。随着新方法的不断出现，这一问题逐步得到了解决。比如直接从环境样品中提取总ＤＮＡ，进行分子生物学、分子系统发育分析的免培养方法，为揭示自然环境微生物多样性提供了一条新的途径１８９１。此类方法的关键是寻找一类合适的分子标记，核糖体小亚基１６ｓＲＮＡ中某些区段的核茁酸序列在几乎所有微生物中具有高度保守性，而另一些区域的核茁酸序列则随着进化而发生变化，以保守区的一部分序列作为引物，扩增出可变区，是利用１６ｓＲＮＡ作为分类标准的理论基础。同时，由于１６ｓＲＮＡ基冈的功能一直没有变化，具有包含的信息量较多、存在范嗣广等特点，使】６ｓＲＮＡ的研究得到广泛天注。Ｗｏｅｓｅ在２０世纪７０年代末开始应用１６ｓＲＮＡ序列分析技术对细菌进行系统发育分类的研究１９０１。以１６ｓＲＮＡ序列作为区分微生物的原则已得到普遍承认‘９１１，并被广泛地应用于进化、形态和生态研究【９２．９３１。扩增的Ｖ３区片段长度在２３０ｂｐ左右，在ＤＧＧＥ分离的长度范围之内，冈此以ＤＧＧＥ分离后的图谱作为十壤原核微生物区系变化的指标。运用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法来进行士壤微生物区系的分析，避开了传统十壤微生物的培养环１了，从而避免了一个人为选择的过程，Ｉ灭Ｉ而能够更为全面的反映十壤微生物区系的变化。本章从传统的平板培养法和微生物分子生态学两个方面方法紊Ｊ－ＰＣＰ处理过的土壤进彳亍研究，以期获得ＰＣＰ对土壤微，｛三物的影响情况，从而全面的了解ＰＣＰ对土壤微生物及微它态的影响。７微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解荫的筛选２．１材料与方法２．１．１材料供试十壤取自河南省农业厅无公害蔬菜试验基地，采样地五氯酚没有污染区。采取５点取样法，取０－－－３０ｃｍ的七样，过５ｍｍ的筛后将其充分混匀。土壤基本理化性质见表２．１。表２．１土壤基本理化Ｉｌ生状Ｔａｈｌｅ２．１ＢａｆｉｃＶｈ耐ｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｏｉｌ２．１．２试验药品及仪器２．１．２．１试验药品ＰＣＰ（上海试剂一厂化学纯）；溴苯醌氯酰亚胺（Ｆｌｕｋａ）；十二烷基磺酸钠（Ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ，ＳＤＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）：十六烷基一三甲基－溴化胺（ＣｅｔｙｌＴｒｉｍｅｔｈｙｌＡｍｍｏｎｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）（上海博奥生物科技公司）；蛋白酶Ｋ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）（ＡＭＲＥＳＣＯ分装）；二氨基乙基四乙胺（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ，ＥＤＴＡ）（厂“两两陇化‘Ｔ厂）；Ｔｒｉｓ—ｂａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；琼脂糖（Ａｇａｒｏｓｅ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ）；Ｍａｒｋｅｒ九－ＨｉｎｄＩＩｌ及ＤＬ－２０００（大连宝生物生物：ｒ程公司）：尿素、甲酰胺等其他常规试剂均由国内公司生产。２．１．２．２仪器ＡＬＣ－２１０．３型电子天平（Ａｃｃｕｌａｂ公司）。ＨＺＱ．Ｑ振荡器（哈尔滨尔联电子公司），ＰＨＳＪ－３Ｆ型酸度计（上海精密科学仪器公司），３Ｋ１８型冷冻超速离心机（Ｓｉｇｍａ公司），ＴＧＬ一１６Ｇ台式离心机（上海安亭科学仪器厂），ＴＧＬ．１６Ｂｄ＇犁台式离心机（上海安亭科学仪器厂），ＤＹＹ一５型稳压稳流定时电泳仪（北京六一设备厂），ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ４８０型ＰＣＲ仪（Ｐｅｒｋｉｎ—ＥＬｍｅｒ公司），ＧＤＳ．８０００凝胶成像与分析系统，Ｄｃｏｄｅ突变检测仪（美国ＢＩＯ．ＲＡＤ公司）２．１．２．３引物试验使用两对引物由上海生１＝生物上程公司合成。特异性地扩增１６ｓＲＮＡ的Ｖ３区，引物序列为１９８】：Ｆ３４１Ｒ５ｌ８５’５’ＣｇＣＣＣｇＣＣｇＣｇＣｇＣｇｇＣｇｇｇＣｇｇｇｇＣｇｇｇｇｇＣＡＣｇｇｇｇｇｇＡＣＴＣＣＴＡＣｇｇｇＡｇｇＣＡｇＣＡｇＡＴＴＡＣＣｇＣｇｇＣＴｇＣＴｇｇ３’３’２．１．３实验方法２．１．３．１土壤处理及土样采集土样设置四个处理，分别添加ＰＣＰ至１００ｍｇ・Ｋｇ一，２００ｍｇ．Ｋ９１。，５００ｍｇ．Ｋｇ１，１０００ｍｇ・Ｋｇ‘每千克干十。每个处理５Ｋｇｉ，对照为同样士但不；Ｉｊｎｐｃｐ。将ＰＣＰ溶于适量无水乙醇后均匀喷入十壤中，混匀，分装入塑料桶中，室温存放。并定期喷加灭菌的蒸馏水，使１：壤保持一定的水分。定时取样，风干后分为两份，一份进ｆ，微生物计数和酶活力测定，一份８微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选保存备用。２．１．３．２可培养微生物的数量分析称取１０ｇ土样用无菌水１０倍梯度稀释后，取稀释度悬液于各培养基上进行培养计数。取ｌｍＬ稀释液用牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌，３０℃培养２天后开始计数。改良高氏一号培养基表面涂抹法培养放线菌（２００１ａＬ做３个重复，３０℃培养５天后开始计数。取ｌｍＬ１０一～１０４稀释度悬液丁马丁氏（Ｍａｒｔｉｎ）培养基中混菌法培养真菌，为抑制细菌生长，培养基中加入５０ｍｇ．Ｋｇ一链霉素，３０。Ｃ培养３天后开始计数。２．１．３．３土壤酶活性的测定ｍ“引２．１．３．４１０３～１０４稀释度悬液），每稀释度ＰＣＰ的测定：藏红Ｔ＿一分光光度法ｆ９５】２．１．３．５土壤微生物总ＤＮＡ的提取【９６．９７】２．１．３．６总ＤＮＡ的纯化试验使用Ｖｉｔａｇｅｎｅ公司生产的ＤＮＡ凝胶回收试剂盒，用凝胶融化体系融化凝胶，结合ｓｉＬｉｃａ膜选择性吸附ＤＮＡ的原理，从凝胶中回收１００ｂｐ－３０ｋｂ的ＤＮＡ片断。具体操作如下：ｌ、紫外灯下切下２３ｋｂ左右的ＤＮＡ片断，放于已经称过质量的１．５ｍＬ的离心管中。２、放过胶的离心管的重量，减去空离心管的重量，即得到胶的重量，由丁．所用的琼脂糖胶的浓度是０．７％，所以加入ｂｕｆｆｅｒＤＥ—Ａ的体积是凝胶质量所对应的“Ｌ数的３倍体积。３、加入ＤＥ．Ａ的凝胶悬浮均匀后于７５℃水浴锅中加热，每隔２～３ｍｉｎ混匀一次，直至凝胶块完全融化。４、按照ＤＥ．Ａ体积的０．５倍加入ｂｕｆｆｅｒＤＥ—Ｂ，混合均匀。５、将ＤＮＡ－ｐｒｅｐＴｕｂｅ置－１－２ｍＬＭｉｃｒｏｆｕｇｅＴｕｂｅ中，将步骤４中的混合液移／Ｎ．ＤＮＡ－ｐｒｅｐＴｕｂｅ中，５５００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ。ｍＬＭｉｃｒｏｆｕｇｅ６、弃滤液，将ＤＮＡ・ｐｒｅｐＴｕｂｅ放同到原来的２Ｗｌ，５５００ｒｐｍ离心１ｍｉｎ。Ｔｕｂｅ中，力ｎＡ．５００ｇＬＢｕｆｆｅｒ７、弃滤液，将ＤＮＡ—ｐｒｅｐＴｕｂｅ放同剑原２５５００ｍＬＭｉｃｒｏｆｕｇｅＢｕｆｆｅｒＴｕｂｅ中，加入７００ｇＬＢｕｆｆｅｒＷ２，ｒｐｍ离心１ｍｉｎ，以同样的方法再用７００ｐＬＷ２洗涤一次。ｍｉｎ。ｇＬＥＬｕｅｎｔ，８、将ＤＮＡ—ｐｒｅｐＴｕｂｅ置于１．５ｍＬ离心管中，１２０００×ｇ离心ｌ９、将ＤＮＡ．ｐｒｅｐＴｕｂｅ置丁另一洁净的１．５ｍＬ离心管中，在ｓｉＬｉｃａ膜中央力ａ／ｋ４０室温静置１ｍｉｎ，１２０００×ｇ离一１５，ｌｒａｉｎ洗脱ＤＮＡ。２．１．３．７总ＤＮＡ的电泳检测纯化前后的总ＤＮＡ分别进行０．７％的琼脂糖电泳，点样鬣是４２．１．３．８１６ｓＲＮＡｕＬ，用于检测纯化的效果。Ｖ３片段的扩增ｆ９８Ｊ用丁扩增１６ｓＲＮＡ的Ｖ３区片段的程序如下：用引物又，ｔＦ３４１．ＧＣ和Ｒ５１８（ＭｕｙｚｅｒＧ．ｅｔａｌ，１９９３）来进行扩增人多数细菌１６ｓＲＮＡ基冈Ｖ３区。引物的序列为：Ｆ３４１：５＇ＣＣＴＡＣＧＧＧＡ１９微生物学硕十论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选ＧＧＣＡＧＣＡＧ３。；Ｒ５１８：５‘ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ５１ｕＬ（含２０ｍＭ３’；ＰＣＲ反应体系：ｌＯＸＰＣＲｂｕｆｆｅｒｎｇ，ＴａｑＭｇＣｌ２），引物Ｆ３４１－ＧＣ莉ＩＲ５１８各２０ｐｍｏｌ，ｄＮＴＰｓ５ｍＭ４ｐ．Ｌ，模板５０酶２．５Ｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），３０００ｎｇ的ＢＳＡ（牛血清蛋白），加超纯水至５０“Ｌ。ＰＣＲ反应参数：９４＂Ｃ预变性５ｍｉｎ；１０个循环的９４＂Ｃｌｍｉｎ，６５＂Ｃ１ｍｉｎ，７２。Ｃｍｉｎｌｍｉｎ，退火温度每两循环降低ｌ℃。再在退火温度为５６℃时循环１５次；７２℃延伸５扩增后的ＤＮＡ片断进行ｌ％的琼脂糖电泳，点样量为３“Ｌ。２．１．３．９ＤＧＧＥ分离胶的制备隅９９’１００】２．１．３．１０变形梯度凝胶电泳及分析胶浓度范同３５％．５５％。待胶凝Ｉ刮后，力ＩＡ．ＰＣＲ样品２５ｐＬ，在１２０Ｖ电压，６０＊Ｃ下电泳６凝胶放在ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｈ。ＤＮＡ染色液染色３０ｍｉｎ。用Ｂｉｏｃａｍｐｔ凝胶成像系统拍照，并用Ｂｉｏｒａｄ公司的Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅｏｎｅ软件进行分析。２．２结果与分析２．２．１不同浓度ＰＣＰ处理土壤微生物数量变化２．２．１．１细菌数量的变化由图２．２ｎ－Ｊ以看出，ＰＣＰ浓度为１００ｍｇ・Ｋｇ１、２００ｍｇ・Ｋｇ～、５００ｍｇ・Ｋｇ。１时，对十壤细菌的数量有明显的生长刺激作用，这表现在处理土壤相对于对照十壤细菌数量有明显的增加。但随着时间的延长，这种作月ｊ逐渐减小，这表明十壤中细菌在接受刺激后，对ＰＣＰ有耐受和降解作用的种类经受了选则，而其它菌株虽短时间有所增加，最后仍然被降解菌及耐受菌取代。在高浓度ＰＣＰ（１０００ｍｇ．１（ｇ１）存在的情况下，细菌的数量在短时间内上升，但最后由趋于下降。这可能是随着时间延长ＰＣＰ对细菌的毒性逐渐表现出来。１４０—１２０—＿．卜ｐ１００——●广．ｐ２００瑚｜曷１００耔三・８０—■一ｐ５００镯１２６０蠹菩４０２０Ｏ７１４２ｌ２８３５４２——●一ｐ１０００＋对照天数图２．２不同处理细菌数量变化Ｆｉｇ．２．２ｏｆＴｈｅＮｕｍｂｅｒＣｈａｎｇｅｓｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＤｉｓｐｏｓａｌＢａｃｔｅｒｉａ２．２．１．２放线菌数量的变化土壤放线菌对新鲜的纤维素、淀粉、脂肪、木质素、蛋白质等均有一定的分解能力。由图２．３．－ＪｖＪ，看出，ＰＣＰ在浓度为１００但在浓度为５００ｍｇ．Ｋｇ１、２００ｍｇ．Ｋｇ１时对放线菌有微弱的生长刺激作用。ｍｇ．ＫｇＩ、１０００ｍｇ．Ｋｇ１时，对放线菌有强烈的抑制作用，放线茼的数鞋远低于对照的数量。这表Ｉ妇ＰＣＰ对放线菌的毒性较人，放线蔺可能在十著微生物里面足ＰＣＰ降２０微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选解的次要微生物。１５０——●一ｐ１００—｛．＿一ｐ２００囱１｝熟专．１００—１■一ｐ５００羹笋—。●一ｐ１０００５０十对照７１４２１２８４２Ｏ天数图２．３不同处理放线菌数量变化Ｆｉｇ．２．３ＴｈｅＮｕｍｂｅｒＣｈａｎｇｅｓｏｆＡｃＤｉｆｆｅｒｅｎｔＤｉｓｐｏｓａｌｔｉｎｏｍｙｃｅｓｆｏｒ２．２．１．３真菌数量的变化由图２．４可以看出，真菌对于ＰＣＰ的处理十分敏感。ＰＣＰ在浓度为１００ｍｇ．Ｋｇｍｇ．Ｋｇ～、２００１时，虽然随着时间延长，真菌数量略有上升，但随后又低于对照。当浓度为５００１时，真菌的数量都低丁对照的。这表明ＰＣＰ对真菌具有强烈的毒性。ｍｇ．Ｋｇ、１０００ｍｇ．Ｋｇ由于ＰＣＰ对真菌放线菌的毒性较大，故在十壤中对残留ＰＣＰ的主要生物分解者是细菌。因此可以用ＰＣＰ处理过的土壤为出发筛选对象进行ＰＣＰ降解细菌的筛选。∞：＝ｏ∞净．拍加坫加５Ｏ钿’口＼∞２咖｝∞把璃球图２．４不同处理真菌数量变化Ｆｉｇ．２．４ＴｈｅＮｕｍｂｅｒＣｈａｎｇｅｓｏｆＤｉｓｐｏｓａｌＦｕｎｇｉｆｏｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔ２．２．２土壤酶活性变化２．２．２．１脲酶活性变化２ｌ微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选脲酶是一种酰胺酶，商接参与尿素形态转化堵皂酶促有机质分子中肽键的水解，其活性通常与微生物数量、土壤有机质、全氮和速效氮相关。不同浓度的ＰＣＰ对脲酶活力都有抑制作用，在浓度为１０００ｍｇ．Ｋｇ一时抑制作用更加明显，几乎检测不到脲酶活力（图２．５）。这说明了脲酶蛋白或者产脲酶的微生物对于ＰＣＰ十分敏感，ＰＣＰ的添加造成了对十壤中尿素营养的转化有较人影响。一３．ｂ０—１◆一ｐ１００ｏ—＿．卜ｐ２００——●ｒ—ｐ５００螽２・三１．恤—■卜－ｐ１０００一对照天数图２．５脲酶活力变化Ｆｉｇ．２．５ＴｈｅＣｈａｎｇｅｓｏｆＵｒｅａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙ溢０．２．２．２．２磷酸酶活性变化磷酸酶分为碱性磷酸酶，中型磷酸酶，酸性磷酸酶。在实验中主要检测了碱性磷酸酶的活性变化。土壤磷酸酶的活力在ＰＣＰ的刺激卜．都有上升的趋势。在浓度为５００ｍｇ．Ｋｇ一１时，开始时酶活力有所下降，但很快就恢复到了正常。在１００浓度下，磷酸酶的活力比对照高出较多（图２．６）。ｍｇ．Ｋｇ～，１０００ｍｇ．Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ‘１ｌ６１４ｌ２—＿．卜ｐ１００——●ｒ—ｐ２００‘－—－－－－－一ｐ５００式＿烘岛一１Ｏ８Ｏ６Ｏ４Ｏ２０避≤“＋对照—■一ｐ１０００ｌ玺ｌ２．６磷酸酶活性变化ｆｉｇ．２．６ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ２．２．２．３蛋白酶酶活力变化蛋白酶能够分解蛋白质、肽类为氨基酸，参与调：宵生物的氮素代谢。在十壤ｌｌ】。蛋白酶由于微生物活动、植物根系分泌和动十ｆｆ物残体的分解而富集起来，成为－十．壤中的一种重要胞外酶，该酶具有离体活性侑邑够参与十壤的氮素循环。重金属、有机污染物和不良－Ｌ壤ｐＨ都可以抑制十壤蚩白酶的活性，冈此．蛋白酶活性可以反映十壤的环境质量状况。和脲酶一样，蛋微生物学硕士论文五氯酚对ｒ卜壤微生物ＩＸ系影响及其降解茼的筛选白酶也受到ＰＣＰ的抑制。在ＰＣＰ浓度为１００ｍｇ．Ｋｇ１，２００ｍｇ・Ｋｇ１时，蛋白酶活力略低于对照。在ＰＣＰ浓度Ｙ，Ｊｓｏｏｘ１０ｍｇ．Ｋｇ，１０００ｍｇ．Ｋｇ１时蛋白酶的活力受到很人影响，几乎检测不到酶活力（图２．７），表明ＰＣＰ对土壤质量有很大的影响。＇‘——●一ｐ１００＼∞麟—＿．●一ｐ２００∞皇——●ｒ—ｐ５００式烬—■一Ｐ１０００遵—●一对照连Ⅱ翘弘■筋卫坫Ｊ∞３５１０２０３０４０时间图２．７蛋白酶酶活力变化Ｆｉｇ．２．７ＴｈｅＣｈａｎｇｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙ２．２．３土壤中ＰＣＰ含量的变化在不同浓度卜，ＰＣＰ在十壤中的降解速度不同。随着ＰＣＰ浓度升高，其降低速度也减慢，这充分证明了＂ＰＣＰ的持久性和难降解性（图２．８）。这表明在自然状态Ｆ，ＰＣＰ具有极强的抗生物降解的特性，这也正是ＰＣＰ作为木材防腐剂的原因。１００害８０囊６０妻４０旧２０Ｏ图２．８五氯酚含帚变化Ｆｉｇ．２．８ＴｈｅＣｈａｎｇｅｓｏｆＰＣＰ２．２．４土壤中总ＤＮＡ提取２．２．４．１未纯化时总ＤＮＡ提取的结果微生物学砸十论文再氯盼对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选利川裂解法进行ＤＮＡ的提取，町以看到（Ｈ２９）．ＤＮＡ罄带卜．分亮，提取结粜较好。但是同时肴到，祭特有拖尾现象，表明提取的ＤＮＡ中含有较多的杂质，所以必坝对ｒ）ＮＡ避行纯化。－－图２９总ＤＮＡ提Ｂ的结％Ｆｉ９２９ｔｈｅｍｓｕ｜Ｉｏｆｔｈｅｃｘｔｍｃｔｌｏｎｏｆｔｏｔａ［ＤＮＡＭ．Ｍａｒｋｅｒ＾－Ｈｉｎｄｌｉｔ带１、２、３、４总ＤＮＡｂ…ｌ２．２４２，３、４ｔｏｍ［ＤＮＡ２纯化后的总ＤＮＡ对提取的总ＤＮＡ电泳切胶后用试制盒纯化（图２１０）．片段人小在２３ｋｂ附近，且条带明亮均一．无拖＾Ｅ现象。目２１０纯化目∞２ＤＮＡＦｉｇ２】０ｔｈｅｔｏｔａｌＤＮＡａｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ带ｌ２３、４、５总ＤＮＡ２３、４Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ＾ＩｌｉｎｄＩⅫｅｌ５∞ｌ“ＤＮＡ２．２５】６ｓＲＮＡ的ＰＣＲ扩增采用递减ＰＣＲ（侧２１１），显１ｉＰｃＲ条带明亮均一，无拖尾平¨ｊｊ带，满足ｒＦ步进行ＤＧＧＥ的需耍。微生物学硕上论殳五氯酚对十壤微生物区彖影响及其降解莳的筛选＋－２５０ｂｐ目２ＩＩＰＣＲ∞镕果Ｆｉｇ２ＩＩＴｈｅＲｅｓｕｌｔ５ｏｆＰＣＲＭ—ｍａｋ…ＤＩ２０００带ＩＩａｎｅ２、３、４Ｊ２６、７、ｇ、９１０、１１为ＰＣＲ条带３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ｒｅｓｕｌｔｏｆＰＣＲ２２６变形梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）ＤＧＧＥ的结果２２６１ＰＣＰ处｛ｑ厉的ｌ壤，条带的种类书ｌ亮度部有显著的变化（１－ｑ２１２）．最初空白的条带仅为１２条，经过处理咀厉条带最多增笮２２条，最少降举５桀。｛ｕ对并个处理来说，有衅祭带的变化特别明显，ＨＪ７．ＴＪ相似陛。如箭头Ｉ所指，此条带为各个处理所兆仃，从条带亮胜可以推断其数量变化巨大。在四个处理中，接触ｉ，ＪＰｃｅ后，其数ｆｄ在短时间内迅速上升，但随着时问延臣，数量义开始Ｆ降，变化趋势也比较相似。箭虫２所指的也为批宵条带，从条带旯度上Ⅱ以判断，在低浓度ｒ，微生物数耸二蜓化不足十分明显，世在高浓度ｈ微生物数最先增斤减，证明其对高浓度ＰＣＰ比较敞苍。箭头３、４Ｊ；ｆｆ指条带的变化趋势相似，在低浓度ｒ，随处理时问延Ｋ，其数量１＋’增人趋势，但在高浓度Ｆ，其生长受到抑制。另外，有些条带，如箭头６所不，从条“｝亮度上判断，低浓应时并小十分叫显，在高浓度下，叉呈ｒ鲋的趋磐，ｆ＋训此娄微１ｒ物ｎｒ能为ＰＣＰ的降解茼。Ａ处理的过程中，也柏一Ⅱ５特异性条带出现．如箭头５所示。这些祭∞数世利亮艘的变化，反映丁处理体系中微牛物Ｒ系的变化，特别是对ＰＣＰ有降解和耐受能力冉关苗类的发育过程。微十物学硕士论文７ｎ氯酚埘十壤微十物Ｒ系彤响及其降解苗的筛选目２１２Ｔ目处４自ＤＧＧＥ结｝Ｆｉｇ２Ｉ２ｔｈｅＤＧＧＥｍｓｕｌｔｍｒｄｉｆｌ／＇ｒｅｎｔｄｉｓｐｏｓａ］ｓ带Ｉ对照带２－５ｐｃｐｌ００Ｘ１０‘处４ｌＯ女、２０ｉ３０＊４０ｉ带６－９ｐｃｐ２ｆＨ］ｘ１０４＊３ｐｅｐＳ００×１０４处４ｍｉ、２０＊３０＊４０＾带１４－１７理１０＊、２０＊帅ｉ４（）＊＊１０．Ｉｐｅｐｌ０００×１０４＊４１Ｄ＊、２０＊３０＊４０＊Ｋｇ】ｆｏｒｌｏｄ２０ｄ３０ｄ４０ｄｌａｎｅ６－ｑＬａｎｅ】“１Ⅻｃ２－５ｄｉｓｕｓｅｄｂｙｐｅｐ（１００ｍｇｄｉｓｐｏｓｅｄｂｙｐｅｐ（２ｆｉｒ｝ｍｇＫｇ‘）ｆｏｒＩＯｄ２０ｄ、３０ｄ、４０ｄｌａｎｅＩＯ－１３ｄｉｓｐｏｓｅｄｂｙｐｅｐ（５００ｍｇｆｏｒｌｏｄ、２０Ｋｇ）ｆｏｒｌｏｄ、２０ｄ、３０ｄ、４０ｄｄ、３０ｄ、４０ｄ］∞ｅ１４－１７ｄｉｓｐｏｓｅｄｂｙｐｅｐ（１０００ｍｇＫｇ。）２．２６２ＤＧＧＥ电泳图片的分析利）ｌｊＱｕａｎｔｉｔｉｖｅｏｎｅ软¨对幽２１２进行分析，ｔ－；ＬＤｉｃｅｃｏｅｆｆｌｃｉｅｍ（Ｃｓ）草化袁｝Ｊ［ＤＧＧＥＨ谱中两个不同样，＊之问的相似程度，ｃｓ值越人表叫相似性越高，著异越小。ＤＧＧＥ相似州ｒ列见表２２。００ｍｇｎＧＧＥ荐处理与空白的相似性为ＰｃＰ浓度为１５３０％～６９Ｋｇ时，其利似性件的变化范ＩＥ山５％，ＰｃＰ浓度为２００ｍｇＫｇ时＋柑似ｔ丰件的娈化范闱Ｊ，Ｊ４７７％～５Ｉ３％，ｌ】ｃＰ浓微生物学硕十论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选度为５００ｍｇ・Ｋｇ１时，相似性性的变化范围为２３．６％～４１．３５，ＰＣＰ浓度为１０００ｍｇ．Ｋｇ１时，相似性性的变化范嗣为２７．２％～３３．５％。从以上的数据可以看出各处理与空白相比较，１００ｍｇ．Ｋｇ１、２００ｍｇ．Ｋｇ５００ｍｇ・Ｋｇ１、１０００１两个浓度与空白之间的相似性比较接近，并且数值基本上都高于４７．７％：ｍｇ・Ｋｇ＂１两个浓度与空白之间的相似性比较接近，且都比较低，最高的仅为４１．３５％。这表明了高浓度的ＰＣＰ对十壤微生物的影响大丁低浓度的。对不同浓度之间相似性的进行比较：可以发现１００ｍｇ．Ｋｇ禾１１２００间的相似度介－Ｊ－４２．３％＇－－－８０．６％，５００而１００ｍｇ・Ｋｇ—ｌ，２００ｍｇ・Ｋｇｍｇ．Ｋｇ１，１０００ｍｇ・Ｋｇ１这两个浓度之ｍｇ．Ｋｇ。１之间的相似性介－Ｊ＂１７．０％－－－．７６．４％，１之间的相似性介于２４．３％～６８．７％，１年，５００ｍｇ・Ｋｇ１，１０００ｍｇ．Ｋｇ通过比较可发现，低浓度之间有较高的相似性，高浓度之间的相似性变化较大，而高浓度和低浓度之间也有较低的相似性。同一浓度不同时刻相似性的比较，可以得出：第１０７２时１００ｍｇ・Ｋｇ１，１０００ｍｇ．Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ１，５００ｍｇ・Ｋｇ＿与空白比较的相似性为：５５．１％，５０．５％，４０．７％，２７．２％；２０天时，变为５３．Ｏ％，４８．２％，２６．６％，３１．７％：３０天时，变为６８．６％，４７．７％，２３．６％，３３．３％；４０大时，变为，６９．５％，５１．３％，４１．３％，３３．５％。由此可以看出在同一时间不同浓度ＰＣＰ处理过的土壤微生物区系相似性经历了由高到低然后同升的变化，且１０００低。由以上的分析可以得出，ＰＣＰ对土壤微生物区系的有比较明显的影响，而且随着ＰＣＰ浓度的升高，这种影响也越大。比较不同浓度处理之间微生物的相似性，可以看出低浓度下，相似性程度高，高浓度下相似性变化较大。这也说明了低浓度下有较多的菌群可以接受ＰＣＰ的诱导而存活，在高浓度下，可能有些菌没米得及适应就已经被淘汰，从而导致土壤微生物种类和数量的较人波动。ＤＧＧＥ图谱的聚类分析见图２．１３。ｍｇ．Ｋｇ１的处理的相似性最ｈ盹２５ｌ‘‘：ｌ，曲１，ｉ蟹蟑ｉｌ蝎蟾ｌ：５啦辱白钮融ＥＯ，ＤＯｅＩ．Ｂ＇蟑ｎ８＾．；，ｌ９０●ＯＯ＂Ｏ５６５ｌＯＯ蟑●５Ｏ譬ＳＯＯＯＯ曲ＯＯ５．＿ｌ：Ｉ＾＾＿●●蟮¨嵋蝣虻６＾－０，５５“引强∞笃ｌ：５＾．Ｅ８啪髓捧虻Ｏ：●嘶篙％．●曲５Ｏ表２．２细菌ＰＣＲ－Ｄ６ＧＥ图谱相似性分析Ｔａｂｌｅ２．２Ｄｉｃｅｅｏｅｆｆｉｃｉｅｒ吐（Ｃｓ）ｅｃｘｔｒｔｐａｆｉｎｇｔｈｅｓｉｍｉｌ缸ｉｌｉｅｓｏｆＤＧＧＥ缸笋ｌａ＇ｉｍｓｆｏｒｂａｃｔ缸ａ２７微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选图２．１３细菌ＤＧＧＥ图谱聚类分析Ｆｉｇ．３．５ＣｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａＤＧＧＥｐａｔｔｅｍ２．３小结不同浓度的ＰＣＰ对十壤微生物的数量有很大的影响：在低浓度时，对细菌有生长刺激作用，对真菌和放线菌有轻微生长刺激作用。在高浓度时，开始时对细菌有生长刺激作用，但细菌的数量很快义开始下降。高浓度对放线菌和真菌都有生长抑制作用，并且放线菌和真菌一直受到抑制。十壤中脲酶，磷酸酶，蛋白酶对ＰＣＰ的敏感程度为：脲酶）蛋白酶）磷酸酶。用细胞裂解法从土壤中提取微生物的总ＤＮＡ，提取效率高，但杂质多。由于十壤中含有人量杂质，必须对从土壤中提取的ＤＮＡ进一步纯化才能进行ＰＣＲ。由于细菌种类的不同，其１６ｓＲＮＡ的ＧＣ含量也不相同，导致复性时退火温度也不同。为了更加全面的反映土壤中微生物的多样性，使用递减ＰＣＲ时非常必要的。从ＰＣＲ结果可以看到，可以满足ＤＧＧＥ的要求。从ＤＧＧＥ的结果可以看出，ＰＣＰ处理后的土壤，条带种类和亮度都有显著变化。它反映了处理体系中微生物区系的变化，特别是对ＰＣＰ有降解和耐受能力有关菌类的发育过程。利用Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅｏｎｅ软件对图３．４进行分析，通过比较可发现，低浓度之间有较高的相似性，高浓度之间的相似性变化较大，而高浓度和低浓度之间有较低的相似性。由此可以得出ＰＣＰ对土壤微生物区系的有比较明显的影响，而且随着ＰＣＰ浓度的升高，这种影响也越大。比较不同浓度处理之间微生物的相似性，可以看出低浓度卜，相似性稃度高，高浓度下相似性变化较人。这也说明了低浓度卜．有较多的菌群可以接受ＰＣＰ的诱导而存活，在高浓度下，可能有些淆没来得及适应就已经被淘汰。微生物学硕十论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选３ＰＣＰ降解细菌的筛选ＰＣＰ在自然状态下保留时间很长，很难降解，给环境带来持续的污染。长期以米，科研工作者寻找可高效降解ＰＣＰ方法的Ｔ作一直没有间断，如物理法【ｌｏｌ】，化学＇法１１０２Ｊ，生物降解【１０３・１０４１等。生物降解作为一种高效清洁的方法有着很人的优势０１０５】：①污染物在原地被降解；②修复时间较短；③就地处理操作简便，对周嗣环境干扰少：④较少的修复金费，仅为传统化学、物理修复金费的３０％－－－５０％：⑤人类直接暴露在这些污染物下的机会减少；⑥不产生二次污染，遗留问题少。对于ＰＣＰ的生物降解国内外做过大量的研究，已报道的降解ＰＣＰ的微生物包括细菌Ｄ０６】，放线菌‘１０７Ｊ，真菌‘１０８１等。本节从经过ＰＣＰ处理的十壤中筛选ＰＣＰ的降解菌，并做了鉴定和降解效果的初步测定，为该菌在生产实践中运用提供了理论和实施依据。３．１材料和方法３．１．１材料ＰＣＰ处理过的土壤３．１．１．１试剂及药品ＰＣＰ（上海试剂一厂化学纯）溴卣里酚蓝（上海试剂三厂）ＳＤＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；ＣＴＡＢ（上海博奥生物科技公司）；蛋白酶Ｋ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ）（ＡＭＲＥＳＣＯ分装）；ＥＤＴＡ（广两两陇化工厂）；Ｔｒｉｓ—ｂａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；琼脂糖（Ａｇａｒｏｓｅ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ）：Ｍａｒｋｅｒ入一ＨｉｎｄＵＩ及ＤＬ一２０００（大连宝生物生物工程公司）；尿素、甲酰胺等常规分析纯试剂均由国内公司生产。３．１．１．２主要仪器和设备恒温培养箱（三东潍坊医疗集团有限公司医疗器械厂）；３Ｋ１８型冷冻超速离心机（Ｓｉｇｍａ公司）；超净工作台（苏州集团安泰公司）：立式圆形压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）；Ｕｖ一２０００型紫外分光光度仪（尤尼柯仪器有限公司）；Ｈ（太仓市光明试验分析仪器厂）；ＤＮＡＧＤＴｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒＺＱ．Ｑ冷冻全恒温震荡器４８０犁ＰＣＲ仪（Ｐｅｒｋｉｎ—Ｅｌｍｅｒ公司）；Ｓ一８０００凝胶成像与分析系统（ＶＩＬＢＥＲＬＯＵ舢雌Ｔ）：ＤｃｏｄｅｍＵｎｉｖｅｒｓａｌＭｕｒａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司）。３．１．１．３培养基Ｉ’０９】ＬＢ液体培养基；无机盐培养基：Ｋ２ＨＰ０４ＭｇＳ０４・７ＨｚＯ１．７３：ＫＨ２Ｐ０４０．６８：ＮＨ４Ｎ０３１．０；Ｏ．１；ＣａＣＬ２・２Ｈ２００．０２：ＭｎＳ０４・Ｈ２０Ｏ．０３；ＦｅＳ０４０．０３：ｐＨ７．４，ＰＣＰ作唯一碳源；分离培养基：稀释的无机盐培养基中添加一定浓度的ＰＣＰ作唯一碳源，同体培养基添加２％琼脂；保存培养基：牛肉膏蟹白胨培养基３．１．２实验方法３．１．２．１富集培养取ＰＣＰ浓度Ｙ０５００ｍｇ．ｋｇ‘１处理过的土壤５ｇ，加入到牛肉高蛋白胨的液体培养基中，内微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解菌的筛选加玻璃珠摇床培养２４３．１．２．２驯化ｈ。取活化液力ＨＡ．Ｎ含Ｗ（ＰＥｐ）＝５０ｌａｇ．ｍＬ一的无机盐培养基中，振荡培养。检ＮＮＰＣＰ降解后，取上清液５ｍＬ，转入含Ｗ（ｐＥＰ）＝１００Ｐｇ・ｍＬ。１的无机盐培养基培养直＿至ｐｃｐ降解。这样经反复驯化，直至培养基中ｗ（ＰＥＰ）提高至５００３．１．２．３分离１１１０】在低缓冲无机盐培养液中加入３～４滴溴百里酚蓝，并加入２％琼脂制成固体培养基，加入ＰＣＰ至ｗ（ＰＣＰ）２００ｌａｇ．ｍＬ‘，取降解高浓度的ＰＣＰ的驯化液稀释涂布平皿，挑取变成黄色的菌落，在以ＰＣＰ为唯一碳源的无机盐培养基中划线分离，再回接剑以ＰＣＰ为唯一碳源，并添加了溴百里酚蓝的无机盐培养液中，挑选由蓝色变成黄色的培养液涂布于含高浓度ＰＣＰ的平皿中。重复以上过程直至获得一株高效降解ＰＣＰ的菌株，编号菌株ＨＰＤ—ｌ。３．１．２．４降解菌的ｄｇｇｅ图谱鉴定对降解菌采取菌落ＰＣＲｌｌｌｌ】：ＰＣＲｆｆ口５０ｐＬ体系，ｂｕｆｆｅｒＴａｑＥ０．６５ｌａＬ，ｐｒｉｍｅｒ１．５ｌａＬ，ｄＮＴＰｌｐＬ，Ｐｇ．ｍＬ～。ｌａＬ（３个单位），补加超纯水至５０“Ｌ，用灭菌牙签挑取培养好的菌少许丁ＰＣＲ管中。ＰＣＲ的反应程序如下：９４℃５ｍｉｎ后，９４℃５０５２。Ｃ７２＂Ｃ４０５０ｓ］ｓ卜一３５个循环Ｓ一７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物检测后与筛菌十壤ＤＮＡ的ＰＣＲ产物进行ＤＧＧＥ。ＤＧＧＥ的胶浓度和方法如前所述。３．１．２．５降解菌的鉴定革兰氏染色法，以及１６ｓＲＮＡ片段测序鉴定。３．１．２．６分析方法ＰＣＰ含量的测定方法１９５】。３．１．２．７降解菌降解效率的及降解条件的初步测定１）降解菌对不同浓度ＰＣＰ的降解效率以ＰＣＰ为唯一碳源，设定１００ｌａｇ．ｍＬ＿ｌ，３００ｌａｇ．ｍＬＩ，５００ｌａｇ．ｍＬｍＬ，３０℃，１５０１三个浓度，３００ｍＬ锥形瓶添加１００ｍＬ液体无机盐培养基，接种３检测ＰＣＰ的降解效率。２）接种量对ＰＣＰ降解效率的影响ＰＣＰ浓度为３００ｌａｇ．ｍＬ～，３００ｒｐｍ摇瓶培养，定时取样，ｍＬ锥形瓶添加１００ｍＬ液体无机盐培养基，分别接种０．５ｍＬ，１ｍＬ，３ｍＬ，５ｍＬ，１０ｍＬＨＰＤ．１菌悬液，３０℃，１５０ｒｐｍ摇瓶培养，定时取样，检测３０微生物学硕十论文五氯酚对十壤微生物Ｍ系影响及其降解菌的筛选ＰＣＰ的降解效率。３）添加定浓度的葡萄糖对ＰｃＰ】｜棼解的影响在３００ｍｇＫ９１ＰｃＰ的基础上，分圳添加１００“ｇｍＬｌ，５００ＰｇｍＬ，１０００ＰｇｍＬ的葡萄糖后．３００ｍＬ锥形瓶添加１００ｍＬ液体无机盐培养基，接种３ｍＬ，３０℃，１５０ｒｐｍ托瓶培养，定时取样，榆洲ＰｃＰ的降解技幸。４）温度７，ｆＰＣＰ降解敬率的影响设定１０℃，２０＇Ｃ，３０＂Ｃ，３７＂Ｃ四个温度，ＰＣＰ浓度为３００Ｐｇ－ｍＬ’，３００ｍＬ锥形瓶添加１００ｍＬ液体无机盐培养基，接种３ｍＬ，Ｉ５０ｍｐｍ摇】｝｛【培养，定时取样，检测ＰｃＰ的降解效率．确定温度对ＰＣＰ降解的影响。５）初始ＤＨ值对降解莳降解敏率的影响ＰＣＰ浓度ＪＪ３００ｇｇｍＬ，３００札锥形瓶湃加１００ｍＬ液体无机盐培养基，初始ｐＨ值分别ｍＬ，３０＂Ｃ，１５０惆至４５，７．０，７．４，８．５，１０．０后，接种３ｒｐｍ摇瓶培养，定时取样，检测ＰＣＰ的醉解效率，确定小同ｐＩＩ值对ＰＣＰ降解效果的影响。６）漆加定浓度表面活性剂对降解做果的影响ＰＣＰ；陂度，Ｊ３００ｆｉｇ．ｍＬ‘，３００ｍＬ锥形瓶装入１００ｍＬ液体无机盐培养草，添加０２％，０５％，Ｉ％表面ｈ‘肚荆．接入３ｍ【，曲液，３０℃，ｌ５０ｍｍ摇瓶培养，定时取样，检＃｛ＵＰＣＰ的降解散率，确定表面｝舌肚剂对ＰＣＰ降解被粜的托响３．２结果与分析３．２】降解菌的筛选由幽３Ｉ可以看忆在蓝底添加３＂ＰＣＰ（ＰＣＰ浓度；ＺＪ４００ｎａｇＫｇ＂‘）为唯碳溺。的培养半板ｌ，有明显的黄色茼落的牛长。将筛选到的蔺株暂命名山ＨＰＤ一１。ｒ一一随一目３Ｉ平扳筛选￡果Ｆｉｇ３ｒｈｅＲｅｓｕｌｔｏｆ／＇ｔａｌｅＳｃｒｅｅｎｉｎｇ３．２２ＨＰＤ．１的进一步确定Ｉ｛ＰＤ．Ｉ降解能力的进一步确定３．２２１为了埘ＨＰＤ．１菌株降解能力进一步确定，设计，对照试验，在以ＰＣＰ为唯一碳游的无机３】微叶！物学硕十论文五氯酚对十壤微十物Ｒ系影响及其降解菌的筛选盐培养基中，添加Ｉ．２滴涣盯里酚蓝，分别接／ｋＥｅｏｌｉＹｑＪＨＰＤ一１．３０＇Ｃ，１５０ｒｐｍ摇床培养。左边的接入ＥｃｏⅣ试管－｝ｊ儿乎吾币刮苗的生Ｋ，经过摇瓶培养后试管仍然为蓝色，而右边的接入筛选到的菌的试管中可“明显地看的菌的牛Ｋ，并且培养液的颜色由蓝乜变为黄色（幽３２），这证明，ＦＩＰＤ．１具有在以ＰＣＰ为唯一碳源的培养液巾生长的能力，即有降解ＰＣＰ的能力。圈３２筛选苗和Ｅｃｏｌｉ降解效果的比较Ｆｉｇ３２Ｔｈｅｃｏｍｐａｒ］ｓｏｎｂｅｌｗｃｅｎｌｈｅｓ…ｎｌｎ㈣…ｄＥｃｏｂ３２２２ＤＧＧＥ图片对照１）ＨＰＤ１的ＰＣＲｆｌ々姑累从幽３３中可咀肴刮．ＰＣＲ的产物在２３０ｂｐ左右，符台进｛ｉＤＧＯＥ的要求。与提取总基…组后进行ＰＣＲ的结果堇木上样，但仃省了人量时间，卅节省了药－‰。目３３＊落ＰＣＲ的结果２）变形梯度凝腔电泳微生物学硕士论文五氯酚对士壤教生物Ｋ系影响及其降解菌的筛选ＨＰＤ．１枉ＤＧＧＥ图片ｌ‘与筛选样本｝壤中的微生物，订｛Ｈ好的对麻（图３４）。确实是经过ＰＣＰ处理后｝壤中的优势茼。目３４ＤＧＧＥ自泳的结果Ｆｉｇ３４ＩｈｅｒｅｓｅｌｌｏｆＤＧＧＥｅｌｅｃｔｒｏ，ｈｏｔｅｓｉｓ带１细萄带２．ｐｅｐ５００ｍｇＫｇ处理４０＊Ｌ∞ｅ１ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌⅫｃ２ｄｉｓｐｏ∞ｄｂｙｐｅｐｏｆ５００ｍ￡・№ｒ１６ｆｏｒ４０ｄａｙｓ将脚３４与前面ｆ１０ＤＯＧＥ蚓片做进一步的对照（幽３５），可咀舌刘与ＨＰＤＩ对应的祭带在ｐｃｐ浓度为】００峙ｍＬ。，２００雌ｍＬ都不搬明艟。莉：ｐｃｐ浓度为５００ｕｇｍＬ时．可咀名劓．凌条带摹本上早增凡的趋贽。这表明ＨＰＤ一１足在加＾高浓度ＰＣＰ后闪具有降解的能山而＾最增碹，也说明了在ＰＣＰ存＾Ｆ１＿壤微生态系统扦历了二次拉育。微生物学顾十论文五氯酚对十壤微生物Ｅ系影响及其降解蔺的筛选圄３５降镕苗的发育对照Ｆｉｇ３５ｔｈｅｃｏｍｐ“ｉｓｏｎｏｆＩｈｅｓｃｒｃｃｎｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ带Ｊ对照带２－５ｐｅｐｌ００ｍｇＫｇ处理１０★、２０＾３０女４０ｉ带６９ｐｃｐ２００ｍｇＫｇ。处Ｋ９１处４１０＊２０＊３０＊４０＊带１４细理ｉｏ＊２０ｉ３０＊４０＊带１０Ｉ３ｐｅｐＳ００ｍｇ菌带１５１…ＩｂｙｌｏｔｌＯｄｐｃｐ５∞ｍｇＫｆｌ处目４０ｉ２０ｄｃｋｌａｎｅ２－５ｄｉｓｐｏｓｅｄｂ。ｐｃｐ（１“）ｍｇ・Ｋｇ）ｆｏｒｌｏｄＫ￡。）‰ｒＩ（Ｈ３０ｄ４０ｄ］ｍｌｅ６－９ｄｉｓｐｏｓｅｄｐｅｐ（５００ｍｇＫｇ）Ｐ∞（２００ｍｇ２０ｄ、３０ｄ、４０ｄｌ∞ｅ】０Ｌ３ｄｉｓｐｏｓｅｄｈｙ２０ｄ、３ｆＪｄ、４０ｄｌａｎｅｌ４ｂａａｅｒｌｕｍｌａｎｅｌ５ｄｉｓｐｏｓｅｄｂｙｐｅｐ５００（ｒａｇＫｇ）ｆｏｒ４０ｄａｙｓ３２３ＨＰＤ．Ｉ的鉴定１革兰氏染色的结果革、二氏染色的结果表明该茼株山革兰氏阴性，短杆状。３．２３３，３３２１６ｓＲＮＡ测序结果（１９０ｂｐ）ＣＣＴＡＣＧＯＧＡＧＵＣＡＧＣＡＧｌＧＧＧＧＡＡｒＡＴＴＧＧＡＣＡＡＴａＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＴＧＣＣＧＣＧｌ￣ＧＴＢＴＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣ丌℃ＧＧ＾Ｔ１℃Ｔ＾ＡＡＧＣ＾Ｃ１ＴＴ＾＾ＧＴＴＧＧＧＡＧＧ＾ＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴｌ’ＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＧＣＧ将霄列提交ＮＣＢＩ上，川ＢＬＡＳＴ分析比较。由结果可以看出，提变的序列与ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＡ（圈３．６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ高的相似件（仪示列）。ｓｐｐＤＬＯＩＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｒｓｐｓｐｓ４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍ１１ＰＣ５０２有较微生物学硕十论文五氯酚对土壤微乍物区系影响及其降解菌的筛选ｑｕｅｒｙ１０ＣＴ＿＾ＣＧＧＧ蜗ＧＣ自ＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＣＡＡＴＧＧＧＯＧ自自自６０Ｃ％ＡＴ０：脚ＡＴＧＣ６０ＳｂｊｃｔＱｕｅｒｙ３０５６１ＣＣＴＡＣＧＧＧＩｎＦ．，ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴｌ；Ｇ鱼Ｃ鱼鱼ＴＧＧＧＯＧＡＡＡＣ，ＯＣＴＧＡＴＯＣ叠觚ＡＴＧＣＣＧＯＧＴＧＩ＿１Ｇ卫Ｇ直囟Ｇ鱼女ＧＧＴＣＴＴＯＣ，ＧＡＴＴＧＴＡ啦Ｃ自ＣＴＴＴ直ＡＧＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＴＡｌＩ｜Ｉ｜｜ＩＩＩＩ｜｜ｆ｜ｌＩＩ｜ｌＩＩＩ｜｜Ｉ｜Ｉ｜｜Ｉ｜ＩｌＩＩＩ｜Ｉ｜ＩＩＩＩｌ｜ＩＩＩＩｌＩ｜ＩＩ｜ｌｌＩＩＩＣＧＣＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧ唐ＪＥ，ＧＴＣＴＴＯＣ，ＧＡＴＴＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＴＡＩｌＩＩ｜ｌＩＩＩＩ｜ＩＩ｜Ｉ｜｜｜｜ＩＩｌ｜ＩＩＩ｜Ｉ｜｜ＩＩｌＩ｜ＩＩＩＩｌＩＩＩｌＩＩ｜Ｉ｜｜ＩＩ｜ｌ｜ＩＩ｜｜｜３６４１２０ＳｂｊｅｔＱｕｅｒｙ３６５１２１４２４１８０ＡＧＴＴＡＡＴＡ０ｃＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＯＧＴＴＡＣ）ＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡ自ＧＣ虻０；ＧＣＴＡＡ（：ＴＴ｜。ＧＴＣ，ＣＣＡＩＩｌｌｌＩｌｌｌＩ｝１１ｌ｜ｆｌｌｌｌｌｌｌｌｌｆｌ｜ＩＩｌｌｉ｜¨｜ｌｌｌＩｌ｜ｌｌｌｌｌｌｌｌｌｉｌ｜ｌｆＩｌＩＳｂｊｅｔＱｕｅｒｙ４．２５１８１ＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＡＯＧＴＴＡＯＣＡＡＣＡＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＯＣ，ＧＣＴＡＡＣＴＴＯ；ＴＧＣＣＡＧＣ．自Ｅ，ＣＣ９１８７４８４Ｉ｜｜ＩＩｌＩ３＂ｏｊｃｔ４８５０Ｃ艇ＣＯＧ４９１图３６降解茵ＩｄｓＲＮＡ部分基因序列与发表序列的比校Ｆｉｇ３五Ｃｏｍｐｓｎｓｃｎｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｎｕｄｅｏｌｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ盯ｎｕｅｌｅｏｌｉｄｅｓｅｑｕｅｎｅｅｏｆｄｅｇｒａｄｉｎｇｓｔｒａｉｎａｎｄｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｄｅ移ａｄｔｎｇｓｔｒａｉｎｖｎｔｈｔｈｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＧｅｎｅｂａｎｋ（Ｑｕｅｆｙｉｓｔｈｅｓｂｊｃｔｉｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓ西Ｏｅｎｅｂａｎ譬）与ＨＰＤ一１序列相似性达９８％的几株菌都属于假单胞菌属（表３．１）。分别具有降解ｐ－ｃｒｅｓｏＬ（对甲酚），ＴＮＴ（三硝基甲苯），Ｔｒｉａｚｏｐｈｏｓ（三唑磷），以及印染Ｔ厂废水的能力。几种被降解的物质都为含有苯环的雉降解的环境污染物。所以可以初步确定ＨＰＤ一１为Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．。裹３－１：降膏罩菌∞ＢＥ．牟羧Ｉ享列测定同源性比对Ｔａｂｌｅ３－１．ＳｅｑＬｅｍｃｅａｒａｌｙｓｉｓｃ—ｏａｎｌｓｅｘｃｉｓｅｄ舀ｏｍＤＧ３Ｅｇ出ｄｅｒｉｖｅｄ丘ｏｍｂ越量血１１６ＳｓｔｒａｉｒｔＨＰＤ．１ｒＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄ蠡锹ＩｂａｍｅｒｈｍｌｄｏｓｔｃｂｅｌｙｒｅｌａｌｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅＩｄｅＳｉｔｙ∞９８％（１８７，１９０）ＡＣＣｅ￥￥ｉｏｎｎｏ．Ｉｓｏ］ａｔｅＬｃｃａｔｉ眦Ｐ＝ｅｕｄｏｍＯＩＡ＝ｓ∞．且ＨＰＩ＞ｌＡＹ７６２３６０ｐ＂ｃｒｅ竹ｌ（耐甲吩）ｄｅｇｒａｄｉｎＥＰｓ锄．由ｍ伍值ｓｓ口．面也０ｌ９８％（１８７／１９０）且Ｆｌ２５３１７＇ｒＮＴ（三硝基甲苯）Ｃ血ｔ钔ｌｉｍｔｅｄ∞ｉｌＰ：帆由ｎ四鼠＝ｊｐ。ａ４９８％（１８７／ｌ刃）Ｄｑ２３ｒ，４９Ｔｒｉ氢盈抽；‘三！生磷）ｄｅＥｒａｔｉｒ堰－ｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍＰｓｅｌｌ∞ｒ帕ｍｓｓｐ．Ｉ＇暇Ｃ５０２９８％（１８７／１９０）ＡＹ８５４１３１ｍｓｔ明Ｌｔｅｒｄｂｒｅｉｘ＠ａｓｔｒｉｅｓ３．２．４ＨＰＤ一１的降解效率测定及降解条件的优化ＨＰＤ．１对不同浓度ＰＣＰ的降解效率３．２．４．１由图３．７可以看剑，ＨＰＤ一１对不同浓度的ＰＣＰ都可以较好的降解。对低浓度的ＰＣＰ期降解速度要快于高浓度的，２０ｈ左右时对１００垤．ｍＬ１浓度的ＰＣＰ降解已达到９５％。高浓度的ＰＣＰ（５００ｍｇ．Ｋｇ。）可能对微生物的生长影响比较大，在２０ｈ降解仅为７５％。这可能与高浓度的ＰＣＰ对ＨＰＤ．１有更人毒性的缘故。３５微生物学硕士论文五氯酚对１：壤微生物区系影响及其降解菌的筛选—◆＿１００丑求姐莲盘—＿Ｉ．－一３００—－广－５００４８１２１６２０２４３６Ｕ，Ｊｆｕ－］（ｈ）图３．７ＨＰＤ－１对小ｌ刮浓度ＰＣＰ的降解效率Ｆｉｇ．３．７ＴｈｅＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎＲａｔｅｏｆＨＰＤ一１ｆｏｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＰＣＰ３．２．４．２接种量对ＰＣＰ降解效率的影响不同接种量对ＰＣＰ降解的影响如图３．８，接种量的大小对ＰＣＰ的降解速率有直接的关系。接种量越高，ＰＣＰ降解效率越高。但如果接种量太人的话，对降解率也没有更多提高。１００９０—＿．一ｌ釜８７００释６０惫５０Ｅ４０—＿．卜３—★－５—■一ｌＯ篷３０澄２０１００４８１２１６２０２４３６时问（ｈ）图３．８接种量对五氯酚降解效率的影响Ｆｉｇ．３．８ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌｕｍｏｎＰＣＰｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ３．２．４．３添加一定浓度的葡萄糖对ＨＰＤ．１降解效率的影响在ＰＣＰ；浓度Ｊｕ３００ｇｇ．ｍＬ＿添加１００ｌａｇ．ｍＬ。１的微量葡萄糖，以检测对ＰＣＰ降解效率的影响。从图３．９中看到，在开始ｔ：ｌ，ＪＰＣＰ的降解效率低丁二没有添加葡萄糖的，但随着时间的延长，１００９０长８０。７０静６０一—－●一３００—．－Ｇ１００——●广－Ｇ５００鑫甚４５００３０２１００Ｏ４８１２１６２０２４莲—■一Ｇ１０００３６时间（ｈ）图３．９葡萄糖对五氯酚降解的影响Ｆｉｇ．３．９ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＧｌｕｃｏｓｅｏｆＰＣＰＯｎ１ｈＰＤｅｇｒａｄａＴｉｏｎ３６微生物学硕十论文五氯酚对ｊ｛ｊ壤微生物区系影响及其降解菌的筛选添加１００”ｇ．ｍＬ１葡萄糖的降解效率逐渐提高，甚至超过了没有添加的。这是因为葡萄糖作为优先碳源被ＨＰＤ．１首先利用，引起有效生物量的增加，并在随后的降解中发挥了作用。但如葡萄糖量太多反而使降解效率下降。３．２．４．４温度对ＨＰＤ．１降解效率的影响温度是影响微生物生长的主要因素，适当的温度有利于微生物生物量的增长和降解酶系的分泌。在低温下（１０℃），对ＨＰＤ．１的降解效率有明显影响，远低于其他温度时的降解效率（图３．１０）。３０℃是降解的最佳温度，这表明此温度是ＨＰＤ．１生长的最适温度。１００ｒ童；９８０｝豫６０ｒ—◆＿１０—．＿２０—★－３０—■一３７引０。４８１２１６２０２４３６时问（ｈ）图３．１０温度对ＨＰＤ一１降解效率的影响Ｆｉｇ．３．１０ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆＨＰＤ－ｌｏｎｔｈｅＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎＲａｔｅ３．２．４．５初始ｐＨ值对ＨＰＤ．１降解效率的影响在中性或偏碱性的条件下，ＨＰＤ—ｌ能有效地降解ＰＣＰ（图３．１１）。在酸性条件下（ｐＨ４．５），ＨＰＤ．１降解能力很低。在较高的ｐＨ值下，降解效率同样受剑较人影响。这可能是在较低或较高的ｐＨ值Ｆ，ＨＰＤ．１的生长受到了影响。同时由于ＰＣＰ的降解过程是一个ｐＨ值逐渐降低的过程，故起始较低的ｐＨ更加不利于ＨＰＤ一１的生长，从而影响降解效果。１００—◆＿４．５鼹８０６０４０２０Ｏ４８１２１６２０２４—－．卜６—★－７釜集罄。遴—８３６时间（ｈ）—■一７．４—◆－１０图３．１１初始ｐＨ值对降解菌ＨＰＤ一１降解效率的影响Ｆｉｇ．３．１１ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＩｎｉｔｉａｌｐＨｏｆＨＰＤ—ｌｏｎｔｈｅＤｅｇｒａｄｔｉｏｎＲａｔｅ３．２．４．６添加一定浓度表面活性剂对ＨＰＤ．１降解的影响ＰＣＰ是一种弱极性的有机化合物，高浓度Ｆ很雉溶丁．水。故在水溶液中很雄形成均相，影响在水中的降解，这也是很多有机化合物在环境中难降解的原冈之一。吐温８０在培养过程中所起的作朋与它的化学结构有很火关系。吐温足多醇类一ＩＩ：离子型表面活性剂，吐温８０分子中含有聚乙氧基亲水链．比吐温２０、吐温６０的亲水链要多，冈而人人改善了Ⅱ上温８０的３７微七物学硕斗＝论文五氯酚对．卜壤微生物区系影响及其降解菌的筛选水溶性和乳化性能（图３．１２）。在添加０．２％吐温８０的情况卜．，的确有助于降解效率的提高。但如果吐温８０浓度过高，反而不利于降解。这可能是因为高浓度吐温８０对ＨＰＤ－１生长的抑制作用。—◆＿Ｏ瓣＾、、Ｅ莲逝—●一０．２——●ｒ０．５—■一ｌ４８１２１６２０２４３６时间（ｈ）图３．１２表面活性剂对ＨＰＤ—ｌ降解效率的影响Ｆｉｇ．３．１２ＴｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＳｓｕｒｆａｃｌａｎｔＯＦｔｔｈｅＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎＲａｔｅｏｆＨＰＤ—ｌ３．３小－结通过平极筛选和摇床发酵对比筛选剑了一株ＰＣＰ的降解菌株ＨＰＤ一１。该菌株在ＤＧＧＥ图谱中也有对照条带为优势菌群。通过革兰氏染色，１６ｓＲＮＡＶ，条带的测序对比可以确定所筛选到的菌为假单胞菌属。通过摇瓶发酵对影响ＨＰＤ一１降解效率的因素作了初步测定。结果如下，ＨＰＤ．１具有较好的降解能力，对３００ｇｇ．ｍＬ１ｆ水ＪＰＣＰ在３６ｈ内的降解效率可以达Ｎ１００％，在５００ｇｇ・ｍＬ‘１的情况下３６ｈ降解效率也可达盈Ｊ９０％以上。接种量为３ｍＬ可以使ＰＣＰ得剑较好降解。添加微昔浓度的葡萄糖有助于ＰＣＰ的降解。温度３０＂Ｃ，ｐＨ值呈弱碱性有助ＴＰＣＰ的降解。添加０。２％的吐温８０也有助于ＰＣＰ的降解。３８微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解荫的筛选４讨论与结论４．１讨论杀虫剂对土壤微生物种群数量影响很大，它们对微生物具有选择性，抑制某些敏感种，而其它种则取代敏感种，维持整体代谢活性不变…２１。由试验也可以看出，ＰＣＰ对十壤的影响讣常人，在低浓度下，它使土壤中的细菌长时间的保持在较高数量上，对放线菌有微弱的生长刺激作用，使真菌受到抑制。高浓度下使细菌、放线菌和真菌都受到抑制，对放线菌和真菌的抑制作用尤其强。这表明ＰＣＰ与其它有机农药不同，具有更人的生物毒性，它与ＰＣＰ本身的理化性质是分不开的。黄耀蓉等【¨３ｌ的研究也表眵］ＰＣＰ钠对土壤生化活性也产生较强的影响。由丁．ＰＣＰ对土壤微生物和十壤生化活性的刺激或抑制作用具有一定的选择性．这导致十壤微生物种群多样性减少和土壤生物化学过程不能正常进行，这些都将给生物多样性保护和和土壤生态系统产生不良后果。土壤酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一，土壤酶和十壤微生物一起共同推动土壤的代谢过程。土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞的分泌物及其残体的分解物，其中微生物细胞是其主要来源…４１。土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向【１１５１，其活性是土壤肥力评价的重要指标之一，同时也是土壤自净能力１９５ｌ评价的一个重要指标。土壤酶的活性与土壤理化特性、肥力状况和农业措施有着显著的相关性。影响土壤酶活性的冈素是多种多样的，其中外来农药的施入是其中的一个方面１１１６】。本霄通过监测了ＰＣＰ处理土壤酶活性变化，追踪ＰＣＰ对土壤酶活性的影响，结果表明ＰＣＰ对十壤酶活力有显著影响。如上所述，土壤酶有一部分来源于土壤微生物，故土壤酶的变化也反映了十壤微生物的变化。但也有可能ＰＣＰ本身就是某种酶的变性剂、抑制剂甚至激活剂，直接导致酶活力下降或上升，这有待进一步研究。实践证明，不经过培养，直接提取微生物的总ＤＮＡ米分析处理设施中的微生物多样性，更可以反映真实的环境情况。任艳红Ｉ¨７１等用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ研究了ＰＣＰ厌氧生物反应器微生物利ｔ群结构的分子特性，在降解ＰＣＰ厌氧污泥颗粒化过程中，反应器内污泥真细菌和古细菌组成都发生了较明显的变化，带谱的变化与反应器运行过程污泥微生物种群演替，特别是ＰＣＰ脱氯降解菌发育有关。本文的研究结果也表明，在不同浓度ＰＣＰ处理的土壤中微生物同样存在这样一种演变。由ＤＧＧＥ图片可以看到，不同浓度ＰＣＰ处理的十壤中的细菌图谱与对照相比，条带数日和亮度都有很大变化，同一种浓度的ＰＣＰ处理的土壤在不同的时间细菌图谱的条带数目和亮度也有很人变化。一方面反映了ＰＣＰ对土壤微生物的影响，从另一方面也说明了ｒ十壤中的ＰＣＰ降解菌和耐受菌在ＰＣＰ处理过程中也接受了选择利淘汰，经历了种群的发育过程，这在ＰＣＰ浓度），Ｊ５００ｍｇ・Ｋ９１，１０００ｍｇ・Ｋｇ。时表现得更加明显。因此，利Ｊ｝｛ｊＤＧＧＥ技术分析微生物１６ＳｒＲＮＡ米确定微生物种群多样性的技术路线是可行的。但作者只是初步研究了ＰＣＰ处理系统中的微生物多样性。要进一步探索ＰＣＰ污染生态系统中微生物的种群构成和系统分类关系，则需要将ＤＧＧＥ分离的条带割胶后再测序。将测序的结果与ＮＣＢＩ搜索３９微生物学硕士论文五氯酚对土壤微生物区系影响及其降解菌的筛选的结果进行比较后，才可确定物种的构成，再通过进化树分析软件的分析，就可以确定物种之间的系统分类关系。但是，后续工作中也有难题，因为ＰＣＲ引物中含有ＧＣ夹板，因此ＰＣＲ产物直接测序的效果不是很好，如果克隆后再测序，费用又增加。十壤环境污染物的微生物降解是比较复杂的生理生化过程，＿十壤微生物的种类、数量、理化特性以及降解效率等与所在土壤类型、土壤物理性质、土壤形成过程、农药种类、农药的化学性质以及外部环境冈子等均有密切关系【ｌ１８】。ＰＣＰ作为一种环境污染物，影响其降解的因素也很多，但寻找一株优势降解菌是第一步。国内外科研工作者在这方面做了人量的研究Ｔ作‘１０６・１０７’１０８１，部分已经走向应用…９１。以前的研究结果表明，高效降解菌的获得大都是从ＰＣＰ污染过的场地中筛选出来的。筛选的方法一般情况下分为两种：流加法和摇瓶传代法。本文用摇瓶传代法从ＰＣＰ处理的土壤中筛选到了一株ＰＣＰ降解细菌，经鉴定为假单胞菌属，这与以前的报道一致［¨们。假单胞菌是土壤中比较丰富的菌群，并且具有降解多种农药的能力‘¨引。随后经ＤＧＧＥ图片对照确实存在，并且是较亮的一个条带，表明该菌确实是处理系统中的优势菌株。并与已报道的菌具有相当的降解能力１１１０１，仍需要进一步进行驯化，提高其降解效率。４．２结论利用传统的平板培养法和ＰＣＲ．ＤＧＧＥ的方法对不同浓度ＰＣＰ（ＰＣＰ）处理的土壤进行了研究并检测了土壤的酶活，最后从ＰＣＰ处理过的土壤中进行了其降解菌的筛选。平板培养显示不同浓度的ＰＣＰ对土壤微生物的数量有很大的影响：在１００ｍｇ・Ｋｇ－１，２００ｍｇ・Ｋ９１，５００ｍｇ・Ｋｇ一时，对细菌有生长刺激作用，细菌数量上升很快，且持续时间比较长。在１０００ｍｇ．Ｋｇｏ时，开始时细菌的生长有刺激作用，细菌数量有所增加，但随着时间延长，细菌数量开始下降，下降趋势比较大，最后甚至低丁．对照。在１００ｍｇ・Ｋｇ～，２００ｍｇ・Ｋｇ叫时，ＰＣＰ对放线菌有微弱的生长刺激作用，在５００ｍｇ・Ｋ９１，１００ｍｇ・Ｋｇ’时，ＰＣＰ对放线菌有强烈的抑制作用，放线菌的数量远低于对照十壤。真菌对于ＰＣＰ的处理十分敏感，任何浓度处理下真菌的数最都低于对照。虽然随着时间延长，真菌数量略有上升，但仍低于对照。这表明ＰＣＰ对真菌具有强烈的毒性。对不同时期的十壤进行了酶活测定。结果表明，ＰＣＰ对脲酶有较强的抑制作用，各处理脲酶酶活力均低丁对照。在１００ｍｇ・Ｋｇ～，２００ｍｇ．Ｋｇ。时，ＰＣＰ对磷酸酶有刺激作用，导致磷酸酶酶活力上升，在５００ｍｇ．Ｋｇ～，１０００ｍｇ．Ｋｇ－１时，开始时磷酸酶酶活力有所下降，但随后酶活力又开始上升，并且高于对照。在１００ｍｇ・Ｋｇ－１，２００ｍｇ．Ｋｇ－１时，蛋白酶酶活力丁对照相蔫不人，在５００ｍｇ．Ｋ９１，１０００ｍｇ・Ｋ９１时，蛋白酶酶活力远低于对照。十壤中脲酶，磷酸酶，蛋白酶对ＰＣＰｆＩ勺敏感程度为：脲酶＞蛋白酶）磷酸酶。从ＤＧＧＥｆｌ勺图片可以看出，ＰＣＰ处理后的土壤，条带的种类和亮度都有显著的变化。它反映了处理体系中微生物区系的变化，特别是对ＰＣＰ有降解和耐受能力有关菌类的发育过程。利ＨｊＱｕａｎｔｉｔｉｖｅｏｎｅ软什对ＤＧＧＥ图片进行分析，结果如下，ＤＧＧＥ各处理与空白的相微生物学硕士论文五氯酚对｜ｔ壤微生物区系影响及其降解菌的筛选似性为，ＰＣＰ浓度为１００ｍｇ・Ｋｇ＿时，其相似性性在５３．０％＂－６９．５％，ＰＣＰ浓度为２００ｍｇ．Ｋｇ‘１时，相似性为４７．７％～５１．３％，ＰＣＰ浓度为５００ｍｇ．Ｋｇ一时，相似性为２３．６％～４１．３５，ＰＣＰ浓度为１０００ｍｇ・Ｋｇ－。时，相似性为２７．２％－－－３３．５％。从以上的数据可以看出各处理与空白相比较，相似程度比较低。对不同浓度之间相似性的进行比较可以发现１００ｍｇ．Ｋｇ一平１１２００ｍｇ．Ｋｇ一这两个浓度之间的相似度介于４２．３％－～８０．６％，５００ｍｇ・Ｋ９１，１０００ｍｇ．Ｋｇ－１之间的相似性介于１７．０％－－－７６．４％，而１００ｍｇ・Ｋ９１，２００ｍｇ・Ｋｇ－１希］５００ｍｇ・Ｋｇ～，１０００ｍｇ・Ｋｇ。之间的相似性介于２４．３％＂６８．７％，通过比较可发现，低浓度之间有较高的相似性，高浓度之间的相似性变化较大，而高浓度和低浓度之间有较低的相似性。由此可以得出ＰＣＰ对土壤微生物区系的有比较明显的影响，而且随着ＰＣＰ浓度的升高，这种影响也越火。比较不同浓度处理之间微生物的相似性，可以看出低浓度下，相似性程度高，高浓度下相似性变化较人。通过平板筛选和摇床发酵对比筛选到了一株ＰＣＰ的降解菌株，暂将其命名为ＨＰＤ．１。它在ＤＧＧＥ图谱中有对照条带且为优势菌群。通过革兰氏染色，１６ｓＲＮＡＶ３条带的测序对比可以确定ＨＰＤ．１属于假单胞菌属。通过摇瓶发酵对影响ＨＰＤ一１降解效率的冈素作了初步测定。结果如下，ＨＰＤ．１具有较好的降解效果，对３００ｇｇ．ｍＬ。１的ＰＣＰ在３６ｈ内的降解效率可以达到１００％，在５００ｇｇ．ｍＬ。的情况下３６ｎＷ解效率也可达到９０％以上。添加微量浓度的葡萄糖有助于ＰＣＰ的降解。温度３０℃，ｐＨ值呈弱碱性有助丁．ＰＣＰ的降解。添加０．２％的吐温８０也有助于ＰＣＰ的降解。４ｌ微生物学硕Ｉｊ论义五氯酚对十壤微生物仄系影响及其降解菌的筛选参考文献［１】李顺鹏．环境生物学［Ｍ】．北京：中国农业出版社，２００２．【２】阎章才，东秀珠．微生物的生物多样性及应用前景【Ｊ】．微生物学通报，２００１，２８（Ｌ）：９６—１０２．［３】ＺＥＬＬＥＳＬ．Ｆａｔｔｙａｃｉｄｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｉｎｓｏｉｌ：ａａｎｄｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｉｎｔｈｅｏｆｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．ＢｉｏｌｏｇｙＦｅｒｔｉｌｉｔｙＳｏｉｌｓ。１９９９，（２９）：１１１－１２９．【４】ＢＡＬＴＲＡＭＡＩＴＹＴＥＤ，ＲＵＴＫＯＶＩＥＮＥＶ，ＳＶＩＲＳＫＩＥＮＥＡ．ＣｈａｎｇｅｓｏｆｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｏｎｃｏｅｎｏｓｉｓｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｒｍｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓｌｕｖｉｓｏｌＣａｌｃ（ａｒ）ｌ—Ｅｐｉｇｌｅｉｃｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｚｅｍｄｉｒｂｙｓｔｅ，Ｍｏｋｓｌｏ－Ｄａｒｂａｉ，２０００，７２：２５２—２６７。【５】李勇．试论士壤酶活性与十壤肥力［Ｊ】．土壤通报，１９８９，２０（４）：１９０—１９３．【６】关松荫．土壤酶及其研究法［Ｍ】．Ｊ匕京：农业出版社，１９８６．［７】孔维栋，刘可星．有机物料种类及腐熟水平对十壤微生物群落的影响【Ｊ】．应用生态学报，２００４，１５（３）：４８７．４９２．【８］张汉波，段吕群，屈良鹄．非培养方法在土壤微生物生态学研究中的应用【Ｊ】．生态学杂志，２００３，２２（５）：１３１－１３６．【９】ＲＯＡＬＤＳＯＲＨＥＩＭ，ＶＩＧＩＤＩＳＬＩＤＴＯＲＳＶＩＫａｎｄＪＯＤＴＥＩＮＧＯＫＳＯＹＲ。Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｏｎｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉａ【Ｊ】．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ，１９８９，１７（２）：１８１—１９２．［１０］ＲＯＢＥＲＴＩ．ＧＲＩＦＦＩＴＨＳ，ＡＮＤＲＥＷＳ．ＷＨＩＴＥＬＥＹ，ＡＮＴＨＯＮＹＧ．Ｏ’ＤＯＮＮＥＬＬｅｔａＬ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｇｒａｓｓｌａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｔｏｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓ【Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（１２）：６９６１—６９６８．ａｎｄＫＨＳＣＫＬＥＩＦＥＲ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｉｔｕ【１１】ＲＩＡＭＡＮＮ，ＷＬＵＤＷＩＧｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｍｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１９９５，５９（１）：１４３—１６９．ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ】．Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ【１２】ＭＵＬＬＥＲＡＫ，ＷＥＳＴＥＲＧＡＡＲＤｍｅｒｃｕｒｙｐｏｌｌｕｔｉｏｎｏｎＫ，ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮｍｉｃｒｏｂｉａｌＳｅｔａＬ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｌｏｎｇ・ｔｅｒｍＥｃ０１．ｔｈｅｓｏｉｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ】．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２００１，３６（１）：１ｌ—１９［１３】ＧＡＲＬＡＮＤＪＬ，ＭＩＬＬＳＡＬ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃｍｉｃｒｏｂｉａｌｏｎｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｃｏｍｍｕｎｉｔｙ—ｌｅｖｅｌｓｏｌｅ—ｃａｒｂｏｎ—ｓｏｕｒｃｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ【Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９１，５７（８）：２３５１—２３５９．９９４．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ【１４】ＺＡＫ，Ｊ．Ｃ．，ＷＩＬＬＩＧ．Ｍ．Ｒ．ＭＯＯＲＨＥＡＤ，Ｄ．Ｌ．ＷＩＬＤＭＡＮ，Ｈ．Ｇ．，１ｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ：ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍｓｉｔｒｙ．１９９４．２６．１ｌ０１．１ｌ０８．４２微生物学硕上论文五氯酚对十壤微生物ｆ爱系影响及其降解菌的筛选【１５】ＫＯＲＮＥＬＩＡＳＭＡＬＬＡ，ＵＴＥＷＡＣＴＥＮＤｏＲＦ，ＨＯＬＧＥＲｓｕｂｓｔｒａｔｅｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｂｙｍｉｃｒｏｂｉａｌＨＥＵＥＲ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＢｉｏｌｏｇＧＮａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４（４）：１２２０—１２２５．【１６】ＨＡＡＣＫ，Ｓ．Ｋ．，Ｈ．ＧＡＲＣＨＯＷ，Ｄ．Ａ．ＯＤＥＬＳＯＮｅｔａ１．Ａｃｃｕｒａｃｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍｏｄｅｌｂａｃｔｅｒｉａｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４．６０：２４８３－２４９３．ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ【Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ【１７】Ｒ．Ｆ．ＨＥＲＲＭＡＮＮ，Ｊ．Ｆ．ＳＨＡＮＮ．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｍｍｕｎｉｔｙＣｈａｎｇｅｓＤｕｒｉｎｇｔｈｅＣｏｍｐｏｓｔｉｎｇｏｆＭｕｎｉｃｉｐａｌＳｏｌｉｄＷａｓｔｅ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ．１９９６，（３３）：７８－８５．［１８】ＫＥＩＴＨ－ＲＯＡＣＨＭ．Ｊ，ＢＲＹＡＮｍｉｃｒｏｂｉａｌＮ．Ｄ．，ＢＡＲＤＧＥＴＴｓａｌｔＲ．Ｄ．ｅｔａ１．Ｓｅａｓｏｎａｌｂｙｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅａｃｉｄｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｆａｍａｒｓｈ，ｍｅａｓｕｒｅｄｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｆａｔｔｙａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，６０（１）：７７－９６．【１９】焦晓丹吴风芝．十壤微生物多样性研究方法的进展【Ｊ］．土壤通报２００４，３５（６）：７８９．７９２．［２０】ＫＯＺＤＲＯＪ，Ｊ，ＶＡＮＥＬＳＡＳ，ＪＤ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｄｉｒｅｃｔａｎｄｉｎｄｉｒｅｃｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｏｉｌＤＮＡｕｓｅｄｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ［Ｊ】．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓ，２０００，（３１）：３７２．３７８．【２１】ＪＺＨＯＵ，ＭＡＡｐｐｌｉｅｄＢＲＵＮＳａｎｄＪＭＴ１ＥＤＪＥ。ＤＮＡｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｓｏｉｌｓｏｆｄｉｖｅｒｓｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，６２（２）：３１６—３２２．ＪＧ，ＫＵＢＥＬＩＫＡＲ，ＬＩＶＡＫＫＪｅｔｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ［Ｊ］。ａｎｄ【２２】ＷＩＬＬＩＡＭＳａｒｂｉｔｒａｒｙａ１．ＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓａｍｐｌｉｆｉｅｄＡｃｉｄｓｂｙｐｒｉｍｅｒｓａｒｅｕｓｅｆｕｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＲｅｓ．１９９０．８（２２）：６５３１・６５３５．【２３］ＹＡＮＧｓｏｉｌＹ，ＹＡＯＪ，ＨＵＳ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆａｇｒｉｃｕＬｔｕｒａｌｃｈｅｍｉｃａｌｓｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ：ＡｓｔｕｄｙｗｉｔｈＲＡＰＤｍａｒｋｅｒ［Ｊ】．Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．Ｅｃ０１．，２０００，３９：７２－７９．［２４］ＳＭＩＴＥ，ＬＥＥＦＬＡＮＧＰ，ＷＥＲＭＡＲＳＫ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｈｉｆｔｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｕｓｉｎｇａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｔｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｉｎｓｏｉｌｃａｕｓｅｄｂｙｃｏｐｐｅｒｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＥｃｏｌｏｇｙ，１９９７，２３（３）：２４９・２６１．【２５】ＷＥＮ－ＴＳＯＬＩＵ，ＴＥＲＥＮＣＥＬ．ＭＡＲＳＨ，ＨＡＮＳＣＨＥＮＧｅｔａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｂｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｅｎｃｏｄｉｎｇ１ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓｏｆｇｅｎｅｓ６ｓＲＮＡ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７，６３（１１）：４５１６－－４５２２．ｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（Ｔ—ＲＦＬＰ）：ａｎｅｍｅｒｇｉｎｇａｍｏｎｇｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ【２６】ＭＡＲＳＨＴＬ．Ｔｅｒｍｉｎａｌｍｅｔｈｏｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇｄｉｖｅｒｓｉｔｙｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ】．Ｃｕｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ．１９９９，２（３）：３２３・７．［２７】ＣＬＥＭＥＮＴＢＧ，ＫＥＨＬＬＥ，ＤＥＢＯＲＤＫＬ，ｅｔａ１．Ｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｐａｔｔｅｒｎｓ。ａ４３微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及ｊ￡降解菌的筛选ｒａｐｉｄＰＣＲ－ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｍｐｌｅｘｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ［Ｊ］．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，ｌ９９８，３ｌ：１３５—１４２．【２８】ＦＲＡＮＫＳＣＨＷＩＥＧＥＲａｎｄＣＨＲＩＳＴＯＰＨＣ．ＴＥＢＢＥ．ＡＮｅｗａｐｐｒｏａｃｈｔｏｕｔｉｌｉｚｅＰＣＲ・・ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ・ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｃｏｍｍｕｎｉｔｙ４８７０．４８７６．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｆｏｒ１６ｓＲＮＡｇｅｎｅ—ｂａｓｅｄｍｉｃｒｏｂｉａｌａｎａｌｙｓｉｓ【Ｊ】．ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６（１２）：【２９】ＪＡＣ－ＣＨＡＮＧＣＨＯａｎｄＳＡＮＧ－ＪＯＮＧＫＩＭ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ—ａｓｓｉｓｔｅｄＰＣＲ－・ｓｉｎｇｌｅ・・ｓｔｒａｎｄ－・ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇｓｈｉｆｔｉｎｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｕｒｉｎｇｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎａｌａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ【Ｊ】．ＷｏｒｌｄＪｏｕｍａｉｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０００．１６（３）：２３１－２３５．ＣＳ，ＨＩＧＧＩＮＳＣＦ，ＳＨＡＲＰＰＭ．ＥＲＩＣｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ａｎｏｖｅｌｆａｍｉｌｙｏｆｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＳａＬｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍａｎｄｏｔｈｅｒ【３０】ＨＵＬＴＯＮｅｌｅｍｅｎｔｓｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉ０１．１９９１，５（４）：８２５－８３４．［３ｌ】ＭＵＹＺＥＲＧ，ＳＭＡＬＬＡＫ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＴＧＧＥ）ｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ【Ｊ】．ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．１９９８，７３（１１：１２７－１４１．【３２１ＳＥＫＩＧＵＣＨＩＨ，ＷＡＴＡＮＡＢＥＭ，ＮＮＡＫＡＨＡＲＡＴ，ｅｔａｌ。Ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｌｏｎｇｔｈｅｃｈａｎｇｊｉａｎｇｒｉｖｅｒｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄｃｌｏｎｅｌｉｂｒａｒｙａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，６８（１０）：５１４２－５１５０．【３３】ＭＵＬＬＥＲａｎｄＡＫ，ＷＥＳＴＥＲＧＡＡＲＤｏｆｓｏｉＬｍｉｃｒｏｂｉａＬＫ，ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮＳ，ＳＯＲＥＮＳＥＮＳＪ．Ｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏｆｕｎｃｔｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ［Ｊ］．ＭｉｃｒｏｂｉａＬＥｃｏＬｏｇｙ，２００２，４４：４９—５８．［３４】Ｒ６ＬＩＮＧＷＦＭ，ＶＡＮＢＲＥＵＫＥＬＥＮＢＭ，ＢＲＡＳＴＥＲＭ，ＬＩＮＢ，ｅｔａ１．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓａｂｅｔｗｅｅｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｈｙｄｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉｎｌａｎｄｆｉｌｌｌｅａｃｈａｔｅｐｏｌｌｕｔｅｄａｑｕｉｆｅｒ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ［３５】ＭＹＥＲＳＤＮＡａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６７（１０）：４６１９－４６２９．ＲＭ，ＦＩＳＨＥＲＳＧ，ＬＥＲＭＡＮＬＳ，ｅｔａ１．ＮｅａｒｌｙａｌｌｓｉｎｇｌｅｂａｓｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｓｊｏｉｎｅｄｔｏａＧＣ－ｃｌａｍｐｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，ｌ９８５，ｌ３（９）：３１３１—３１４５．Ｇ，ｅｔａ１．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｒｈｉｚｏｂｉａ［３６】ＶＡＬＬＡＥＹＳＴ’ＴＯＰＰＥ，ＭＵＹＺＥＲｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｉｎｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔ６ｓＲＮＡａｎｄｍｅｔｈａｎｏｔｒｏｐｈｓ【Ｊ】．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ【３７】ＭＵＹＡＥＲＧ，ＳＭＡＬＬＡＥｃｏｌｏｇｙ，１９９７，２４：２７９—２８５．Ｋ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＤＧＧＥ）ａｎｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＴＧＧＥ）ｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｃｏｌｏｇｙ［Ｊ］．Ａｎｔｏｎｉｅｖａｎ微生物学硕上论文五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解荫的筛选Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，１９９８，７３（１）：１２７－１４１．【３８】ＧＥＬＳｏＭｎ、ＪＡＡ，ＫＥＩＪＺＥＲ—ＷＯＬＴＥＲＳＡＣ，ＣＡＣＣｏＧ，ＶＡＮＥＬＳＡＳＪＤ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｓｏｉｌｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９９９，３８：１－１５．ｅｔ【３９】Ｓ．ＶＯＧＥＴ，Ｃ．ＬＥＧＧＥＷＩＥ，Ａ．ＵＥＳＢＥＣＫｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ［Ｊ】．Ａｐｐｌｉｅｄ［４０】ＭＩＣＨＥＬＬＥａ１．ＰｒｏｓｐｅｃｔｉｎｇｆｏｒｎｏｖｅｌｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓｉｎａｓｏｉｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９：６２３５—６２４２．Ｒ．ＡＵＧＵＳＴ，ＡＬＡＮＤ．ｅｔａ１．ＣｌｏｎｉｎｇｔｈｅｓｏｉｌＲ．ＲＯＮＤＯＮ，ＰＡＵＬｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ：ａｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒａｃｃｅｓｓｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０００，６６：２５４１－２５４７．【４ｌ】史雅娟，吕永龙，任鸿昌等．持久性有机污染物研究的国际发展动态【Ｊ１。世界科技研究与发展．２００３，２５（２）：７３—７８．【４２】迟杰．五氯酚在区域水环境中归趋的研究［Ｊ】．南开大学学报．２０００．【４３】张兵，郑明辉．五氯酚在洞庭湖环境介质中的分布【Ｊ】．中国环境科学．２００１，２１（２）：１６５．１６７．【４４】王宏，杨霓云，沈英娃等．海河流域几种典型有机污染物环境安全性评价【Ｊ］．环境科学研究２００３。１６（６）：３５・３７．【４５】ＴＨＯＭＰＳＯＮ．Ｔ．Ｓ。ｅｔａ１．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｓｕｒｖｅｙｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｌｅｖｅｌｓｉｎｈｕｍａｎｕｒｉｎｅ［Ｊ】．Ｂｕｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍ．Ｔｏｘｉｃ０１．１９９４，５３：２７４—２７９．【４６】ＣＥＳＳＮＡ．Ａ．Ｊ．ｅｔａ１．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｉｉｎａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃａｍｐｌｅｓｆｒｏｍｔｈｒｅｅ５８：６５１－６５８．Ｃａｎａｄｉａｎｌｏｃａｔｉｏｎｓ【Ｊ］，１９９４．Ｂｕｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍ．Ｔｏｘｉｃ０１．１９９７，【４７】ＤＡＮＩＥＬ．Ｖ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｈｕｍｏｒａｌｏｆｅｌｅｖａｔｅｄｂｌｏｏｄｌｅｖｅｌｓｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｉｗｉｔｈｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｈｅａｌｔｈ．２００１，５６（１）：７７—８３．ｏｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ【Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓＪ．Ｅｆｆｅｃｔｓ【４８】ＳＡＬＭＩＮＥＮＪ．，ＨＡＩＭｌｓｏｉｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰＣＰｓｏｉｌｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｒｆｏｒｅｓｔｏｆａｐｐｌｉｅｄｅｃｏｌｏｇｙ．１９９７．３４（１）：１０１—１１０．ｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ【４９】ＳＴＥＩＥＲＴＪ．Ｇ．Ｎｕｃｌｅａｒａｎｄａｓｔｕｄｉｅｓｏｆｅｌｅｃｔｓｏｆｓｏｍｅｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｓ９９７，ｌ７０：４９５４－４９５７．ｏｎＥ．ｃｏｌｉｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇＤ．Ｇ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ】．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ［５０】ＣＲＯＳＢＹｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｉ［Ｊ］．ＰｕｒｅＡｐｐｉＣｈｅｍ１９８１，５３：１０５１—１０８０．［５１】ＭＡＫＩＮＥＮ，Ｐ．ＭＴＨＥＮＯＴ．Ｊ．，ＦＥＲＧＵＳＯＲＪ．Ｆ．Ｃｈｉｏｒｏｐｈｅｎｏｌｔｏｘｏｃｉｔｙｒｅｍｏｖａｌａｎｄｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｉｎａｅｒｏｂｉｏｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｒｅｃｏｖｅｒｙｆｒｏｍｐｒｏｃｅｓｓ２７：１４３４．１４３９．ｕｐｓｅｔ【Ｊ】．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．ｔｅｃｈｎ０１．１９９３，［５２］ＴＳＥＫ．Ｋ．Ｃ．ａｎｄＬＯＳ．Ｌ．ＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＰＣＰ—ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｓｏｉｌ：ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｒａｔｕｒｅ［Ｊ］，Ｗａｔｅｒ【５３】ＬＥＥＲｅｓｅａｒｃｈ．２００２，３６：２８４—２９０．ｏｎＬ…ＳＲＡＯＰ．Ｓ．Ｃ．，ＮｋｅｄｉＫ．Ｐ．，ｅｔａ１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｓｏｌｖｅｎｔａｎｄｓｏｒｂｅｎｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ４５微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物区系影响及１ｅ降解菌的筛选ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｌｉｎｏｃｔａｎｏｌ・－ｗａｔｅｒａｎｄｓｏｉｌ．－ｗａｔｅｒｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］，Ｅｎｖｉｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ，ｌ９９０，２４：６５４－６６１．［５４】ＦＵＫＵＳＨＩＭＡＭ，ＴＡＴＳＵＭＩｏｎＫ．ａｎｄＭＯＲＩＭＯＴＯＫ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ａｎｄｈｕｍｉｃａｃｉｄｏｆｔｈｅｐｈｏｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎＰＣＰ［Ｊ］，ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，１９（７）：１７１１一１７１６．［５５】ＫＯＳＨＩＯＫＡＭ．，ＳＵＺＵＫＩＴ．，ＫＡＮＡＺＡＷＡｉｎｈｅｘａｎｅｂｙｘｅｎｏｎＪ．ｅｔａ１．Ｐｈｏｔｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｌａｍｐ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｅｓｔｉｃｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ，１９８７，１２（２）：２２９—２３６．【５６】ＬＩＵＰ．Ｙ．，ＺＨＥＮＧＭ．Ｈ．ａｎｄＸＵＸ．Ｂ．Ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｃｈｉｏｒｉｎａｔｅｄ—Ｐ－ｄｉｏｘｉｎｓｆｒｏｍｏｎｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｓｏｉｌｓｓｕｒｆａｃｅｓ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２００２，４６：ｌ１９１—１１９３．【５７】ＷＥＡＶＥＲＳＬ．Ｋ．，ＭＡＬＭＳＴＡＤＴｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｄｅｇｒａｄｍｉｏｎＮ．ａｎｄＨＯＦＭＡＮＮＭ．Ｒ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ，ｏｚｏｎａｔｉｏｎａｎｄｓｏｎｏｌｙｔｉｃｂｙｏｚｏｎａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎ０１．．２０００．３４：１２８０—１２８５．【５８】ＢＲＩＬＬＡＳｏｘｉｄａｔｉｏｎＥ．，ＳＡＵＬＥＤＡＲ．ａｎｄＣＡＳＡＤＯＪ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆ４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｂｙａｎｏｄｉｃｅｌｅｃｔｒｏ—Ｆｅｔｎｏｎ，ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏ－Ｆｅｎｔｏｎ，ａｎｄｐｅｒｏｘｉ—ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．．１９９８．１４５：７５９—７６５．【５９】ＯＴＵＲＡＮＭ．Ａ．，ＯＴＵＲＡＮＮ．，ＬＡＨＩＴＥＣ．ｅｔａ１．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｒａｄｉｃａｌｓａｎｂｙｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙａｓｓｉｓｔｅｄＦｅｎｔｏｎ’Ｓｒｅａｇｅｎｔａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｃｍｉｃｒｏｐｏｌｌｕｔａｎｔ，ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，５０７：９６—１０２．ｏｆＥｉｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ［６０】湛雪辉，黄艳，湛含辉等．五氟氯乙烷的钯催化法加氢脱氯反应研究【Ｊ］．环境科学研究，２００３，１６（２）：６１—６４．【６１】ＭＯＲＡＬＥＳＪ．，ＨＵＴＣＨＥＳＯＮＲ．ａｎｄＣＨＥＮＧＩ．Ｆ．ＤｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｐｈｅｎｏｌｓｂｙｕｎｃａｔａｌｙｚｅｄＦｅ（Ｏ）ａｎｄｃａｔａｌｙｚｅｄａｎｄＭ敷Ｏ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｚａｒｄｏｕｓＭａｔｅｒｉａｌｓＢ，２００２，９０：９７—１０８．【６２】ＴＳＥＫ．Ｋ．Ｃ．ａｎｄＬＯＳＬ．ＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆＰＣＰ—ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｓｏｉｌ：ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．ＷａｔｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３６：２８４—２９０．Ａ．Ｇ．ａｎｄ［６３】ＡＵＧＵＳＴＩＮＢ，ＨＯＭＳＢＹｄａｔａｂａｓｅｆｏｒＷＡＮＨＯＰＥｍａｋｉｎｇＲ．Ｄ—ＳＣＳ／ＡＲＳ／ＣＥＳｐｅｓｔｉｃｉｄｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｄｅｃｉｓｉｏｎＩＩａｄｄｉｔｉｏｎａｌｃｏｍｐｏｕｎｄｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｉｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ，１９９４，１３７：１－８２．【６４】ＨＯＷＡＲＤＰ．Ｈ．（Ｅｄ．）．ＨａｎｄｂｏｏｋＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ【６５】ＭＣＡＬＬＩＩＳＴＥＲｏｆｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｏｒｇａｎｉｃｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬｅｗｉｓＹｏｒｋＮＹ，１９９７，９７．Ｋ．Ａ．，ＬＥＥＨ．ａｎｄＴＲＥＶＯＲＳＪ．Ｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ【Ｊ】．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，１９９６，７：１－４０．【６６】ＬＩＵＤ．。ＴＨＯＭＳＯＮＫ．。ａｎｄＳＴＲＡＣＨＡＮＷ．Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎａ微牛物学硕十论文五氯酚对十壤微生物区系影响及ｊｅ降解菌的筛选ｓｉｍｕｌａｔｅｄａｑｕａｔｉｃｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ【Ｊ】．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｉｎ．ｔｏｘｉｃ０１．１９８１，２６（１）：８５—９０．【６７】ＢＯＹＬＥＴ．Ｐ．，ＲＯＢＩＮＳＯＮＷ．Ｅ．Ｆ．ａｎｄＰＥＴＴＹＪ．Ｄ．ｅｔａ１．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｓｉｍｕｌａｔｅｄｌｅｎｔｉｃｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ［Ｊ］．ＢｕｌｌｅｔｉｎｏｆＥｎｖｉｒｏｎ．ＣｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１９８０，２４（２）：１７７－１８３．【６８】ＢａｋｅｒＭ．Ｄ．，ａｎｄＭａｙｆｉｅＬｄＣ．Ｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌａｎｄｐｈｅｎｏｌｉｎａｎｄｎｏｎ－ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｓｓｏｉ［Ｊ】．Ｗａｔｅｒ，ＡｉｒａｎｄＳｏｉｌＰｏｌｌｕｔｉｏｎ，１９８０，１３（４）：４１１－４２４．［６９】１ＤＥＡ，Ｎ１ＫＩＹａｎｄＳＡＫＡＭＯＴＯＦｅｔ．ａ１．ＤｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｐａｄｄｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９７２，３６（１１）：１９３７—１９４４．ｓｏｉｌ［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ【７０】ＺＥＬＬＥＳａｎｄＬ．，ＥＬＫＡＫＫＡＮＹｏｎＳ．ａｎｄｏｆＳＣＨＥＵＮＥＲＴＬｅｔ．ａ１．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ－１４ＣｖａｒｉｏｕｓｓｏｉｌｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄＨｇＣｌ２ｔｈｅｍｉｃｒｏｆｌｏｒａｖｏｌａｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，１９８９，１９（１０－１１）：１７２１—１７２７．［７１】ＣＨＡＮＧａｃｃｅｐｔｏｒｓＢ．Ｖ，ＺＨＥＮＧＪ．Ｘ，ａｎｄａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＹｕａｎＳ．Ｙ．ｅｔａ１．Ｅｆｅｃｔｓｏｎｏｆａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｅｌｅｃｔｒｏｎｄｏｎｏｒｓ，ｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎｉｎｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，１９９６，３３（２）：３【７２】Ｄｅ１３—３２０．ＬＡＵＮＥＲ．Ｄ，ＧＡＭＢＲＥＬＬＲ．Ｐ．ａｎｄＲＥＤＤＹＫ．Ｓ．ＦａｔｅｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｎｅｓｔｕａｒｉｎｅＰｏｌｌｕｔｉｏｎ，Ｂ．，１９８３，６（４）：２９７－３０８．ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｉｅｌｄｓｏｉｌｓｔｒｅａｔｅｄｓｅｄｉｍｅｎｔ【Ｊ】．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ【７３】ＷＡＴＡＮＡＢＥＬ，Ｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＰＣＰ）ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇａｎｎｕａｌｌｙｗｉｔｈＰＣＰ【Ｊ】．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７８，１０（１）：７１—７５．【７４】ＭＡＮＮＩＳＴＯＭ．Ｋ．ＳＡＬＫＩＮＯＪＡ—ＳＡＬＯＮＥＮＭ．Ｓ．ａｎｄＪ．ＰＵＨＡＫＫＡＡ．ＩｎｓｉｔｕｐｏｌｙｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌＢｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｔｈｅｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｏｆｂｏｒｅａｌｇｒｏｕｎｄｗａｔｅｒ［Ｊ】．Ｗａｔ．Ｒｅｓ．２００１，３５（１０）：２４９６—２５０４．【７５】ＳＭＩＴＨＪ．Ａ．ａｎｄＮＯＶＡＫＪ．Ｔ．，Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｐｈｅｎｏｌｓｉｎｓｕｂｓｕｒｆａｃｅｓｏｉｌｓ［Ｊ］．ＷａｔｅｒＡｉｒ【７６】ＤＥＣａｎｄＳｏｉｌＰｏｌｌｕｔｉｏｎ，１９８７，３３（１－２）：２９－４２．Ｊ．ａｎｄＢＯＬＬＡＹＪ。Ｍ．ＤｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｐｈｅｎｏｌｓｂｙＯｘｉｄｅ—ｒｅｄｕｃｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｓｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｒｅａｃｔｉｏｎｓ【Ｊ］．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＥｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍｉｎ．ａｎｄＴｏｘｉｃｏＬ．，１９９０，（１９）：５４３．５５０．［７７】ＪＯＮＧＷ，ＰＡＲＫＪ．Ｄ．ａｎｄＪＡＮＧＥ．Ｋ．ｅｔ．ａＬ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄｐｈｅｎｏｌｓａｎｄａｎｉｌｉｎｅｓｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｈｕｍｉｃａｃｉｄ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｑｕａｉ，２０００，（９）：２１５—２２０．【７８】ＩＴＯＨＫ．ＦＵＪＩＴＡＭ．ａｎｄＫＵＭＡＮＯＫ．ｅｔ．ａ１．Ｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄｓａｆｆ爸ｃｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｏｆｂｙａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｓ（３２）：８５．９１．Ｃｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒｌａｃｃａｓｅ［Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌｏｇｙＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，【７９】ＫＬＩＢＡＮＯＶＡ．Ｍ—Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅｍｏｖａｌｏｆｐｈｅｎｏｌｆｒｏｍｃｏａｌｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｗａｓｔｅｗａｔｅｒ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８３．（２１）：２５９－２６１．【８０】ＡＵＳＴＳ．Ｄ．ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔａｎｔｓｂｙＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ４７微生物学硕士论文五氯酚对十壤微生物Ｉｉ系影响及ｊ￡降解菌的筛选【Ｊ】．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃ０１．，１９９０，（２０）：１［８１】ＭＵＲＡＮＤＩ９７—２０９．ＢＥＮＯＩＴＧ．ｅｔａｉ．ＦｕｎｇａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆＳ．Ｆ．，ＳＴＥＩＭＡＮ，Ｒ．ａｎｄｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｂｙｍｉｃｒｏｍｙｃｅｔｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ０１．，１９９３，（３０）：２７—３５．Ｄ．ａｎｄＫＡＤＲＩＭ．ｅｔ，ａＬ—ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｃａｐａｂｉｌｉｔｙｏｆＡｂｓｉｄｉａ【８２】ＧＵＩＲＡＵＤＰ．，ＶＩＬＬＥＭＡＩＮｆｕｓｃａｌｉｎｎｅｍａｎｎｔｏｗａｒｄｓｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｏｌｌｕｔａｎｔｓ［Ｊ】．Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，２００３．Ｐｅｔ［８３］ＴＯＢＩＡＲ．Ｊ．，ＣＡＭＡＣＨＯＪ．Ｍ．ａｎｄｃｒｅｏｓｏｔｅＡＵＧＵＳＴＩＮａＬ．ＷａｓｈｉｎｇｓｔｕｄｉｅｓｆｏｒＰＣＰａｎｄｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄＴ．Ｌ．，ＳＯＮＧｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｊ．ＨａｚａｒｄｏｕｓＭａｔｅｒ．，１９９４，（３８）：１４５－１６１．Ｍ．Ｓ．ａｎｄＢＩＥＬＥＦＥＬＤＴＡ．Ｒ．Ｎｏｎｉｏｎｉｃｓｕｒｆａｃｔａｎｔｅ．ｅｃｔｓｏｎ【８４】ＣＯＲＴｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ】．ＷａｔｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，（３６）：１２５３－１２６１．［８５】龚平，孙铁珩，李培军．农药对土壤微生物的生态效应［Ｊ】．应用生态学报．１９９６，（７）（ｓｕｐ．）：１２７．１３２．［８６】ＧＯＮＺＡＬＥＺ－ＬＯＰＥＺ，Ｊ．ＭＡＲＴｎｑＥＺ—ＴＯＬＥＤＯ，Ｍ．Ｖ．ａｎｄＳＡＬＭＥＲＯＮａｃａｒｉｃｉｄｅｂｒｏｍｏｐｒｏｐｙｌａｔｅｏｎＶ．Ｅｆ．ｆｅｃｔｏｆｔｈｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｓｏｉｌｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ【Ｊ］．ＳｏｉｌＢｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，２４（８）：８１５—８１７．【８７】ＴＵ，Ｃ．Ｍ—Ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｒｅｅｎｅｗｅｒｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌａｎｄｅｎｚｙｍｅｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｓｏｉｌ［Ｊ］．Ｂｕｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍ．Ｔｏｘｉｃ０１．，１９９２，（４９）：１２０—１２８．【８８】陈金龙，许昭恰，赵玉明等．树脂吸附法处理五氯酚钠生产废水【Ｊ】．离子交换与吸附，１９９６，１２（２）－１２９～１３５．［８９】ＰＡＣＥＮＲ，ＳＴＡＨＬＤＡ，ＬＡＮＥＤＪ，ｅｔａ１．Ｔｈｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｎａｔｕｒａｌｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（９）：５１－５５．ｂｙｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｃｏｌｏｇｙ。１９８６，【９０】ＣＥＥＳＷ，ＪＡＣＱ【９ｌ】ＪＲＡ，ＤＥＫＯＮＩＮＧ，ｅｔａＬ．ＭｙｃｏＬｏｇｉａ［Ｊ］．１９９６，（８８）：３６１－３６８．ＣＡＮＡＲＤＢ，ＧＡＲＮｌＥＲＴ，ＬＡＦＡＹＢ，ｅｔａ１．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｉｃａｎａｅｒｏｂｅｃＬｏｓｔｆｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｕｓｉｎｇｔｈｅ１６ｓＲＮＡＮｕｅｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅ［Ｊ］．ＩｎｔＪＳｙｓｔＢａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９２，４２（２）：３１２－３１４．［９２】ＬＡＲＳＥＮＮ，ＯＬＳＥＮＧＪ，ＭＡＩＤＡＫＢＬ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｒｉｂｏｓｏｍａｌｄａｔａｂａｓｅｐｒｏｊｅｃｔ［Ｊ】．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９３，２１（３）：３０２１・３０３２．【９３】ＷＯＥＳＥＣＲ．，ＢａｃｔｅｒｉａｌＥｖｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ】．ＭｉｅｒｏｂｉｏｌＲｅｖ，１９８７，５１（２）：２２ｌ－２７１．【９４］李阜棣，喻子牛，何绍江．农业微生物学实验技术［Ｍ】．北京：中国农业出版社，１９９６．【９５］水质ＰＣＰ的测定一藏红Ｔ分光光度法，中华人民共和国国家标准ＧＢ９８０３—８８．［９６】张瑞福，曹慧，崔中利．土壤微生物总ＤＮＡ的提取和纯化【Ｊ】．微生物学报，２００３，４３（２）：２７６—２８２．【９７】ＶＩＧＩＤＳＴＯＲＳＶＩＫ，ＪＯＳＴＥＩＮＧＯＫＳＯＹＲ，ａｎｄＦＲＩＤＡＬ１ＳＥＤＡＡＥ，ＨｉｉｇｈｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎＤＮＡｏｆｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９９０．５６（３）：７８２—７８７．［９８】胡元森．黄瓜连作障碍冈子分析及其生物修复措施探讨【Ｍ】．南京农业人学，博｝＝论文．４８微生物学硕｛：论文五氯酚对十．壤微生物区系影响及ｌｅ降解菌的筛选【９９】夏北成，ＺｈｏｕＴｉｅｄｊｅ，ＪＭ．分子生物学方法在微生物生态学中的应用【Ｍ】．中山大学学报．１９９８．３２（２）：９７—１０１．【１００】ＣＡＲＭＩＮＥａｐｐｒｏａｃｈｅｓＣＲＥＣＣＨＩＯ，ＭＡＤＤＡＬＥＮＡＣＵＲＣＩ，ＭＡＲＩＡＤＯＮＡＴＡｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｈｅｒｂｉｃｉｄｅ—ｉｎｄｕｃｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｈａｎｇｅｓｉｎｓｏｉｌｍｉｃｒｏｃｏｓｍｓ［Ｊ］．ＢｉｏｌＦｅｒｔｉｌＳｏｉｌ，２００１，（３３）：４６０—４６６．【１０１】孙磊，蒋新，周健民等．ＰＣＰ污染十壤的热修复初探［Ｊ】．土壤学报，２００４，４１（３）：２４５－２４９．［１０２］ＧＵＰＴＡＳＳ，ＳＴＡＤＬＥＲＭ．Ｒａｐｉｄｔｏｔａｌｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｎｐｈｅｎｏｌｓｂｙａｃｔｉｖａｔｅｄｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６：３２６－３２８．【１０３】吴坤，徐淑霞，贾新成．黄孢原毛平革菌对土壤中ＰＣＰ的降解【Ｊ】．中国农业科学２００４，３７（４）：５７７—５８．【１０４】李海英，李小明，陈昭宜．微生物厌氧降解ＰＣＰ适宜条件的研究【Ｊ】．湖南大学学报（自然科学版），２０００．２，２７（１）：１３．１８．［１０５】夏北成．环境污染物生物降解［Ｍ】．北京：化学工业出版社，２００１．【１０６】ＧＡＲＹＪ．，ＳＴＡＮＬＡＫＥ，Ｒ．Ｋ．ＦＩＮＮ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ．Ａｐｐｌｉｅｄａｎｄａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｅｎｔａｃｈｉｏｒｏｐｈｅｎｏｌ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．１９８２，４４（６）：１４２１．１４２７．【１０７】ＭＡＲＴＩＮＤ．ＷＥＢＢＬ，ＧＲＥＧｂｙＥＷＢＡＮＫ，ＪＯＹｖｉｒｉｄｉｓＰＥＲＫＩＮＳｓｔｒａｉｎｓｅｔａ１．ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍｆｒｏｍｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌＳａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｉｓｏｌａｔｅｄｍｕｓｈｒｏｏｍｃｏｍｐｏｓｔ［Ｊ］．２００１．３３（１４）：１９０３－１９１４．【１０８】ＧＥＲＡＬＤＪ．ＭＩＬＥＳＫＩ，ＪＯＨＮＡ．ＢＵＭＰＵＳ，ｅｔｔｈｅｗｈｉｔｅｒｏｔａ１．ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｂｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆｕｎｇｕｓＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９８８．５４（１２）：２８８５－２８８９．［１０９】ＤＩＡＮＥＬ．ＳＡＢＥＲｓｔｒａｉｎｓＡＮＤｔｈａｔＲ．Ｌ．ＣＲＡＷＦＯＲＤ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｄｅｇｒａｄｅａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｏｆｆＬａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９８５．１２，５０（６）：１５１２—１５１８．［１１０】宋建华，宋冬林，陈涛．ＰＣＰ高效降解菌Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＣＳ５的研究．廊用与环境生物学报．２０００，６（６）：５８６～５９２．【１１１】毛伟华．菌落ＰＣＲ产物直接测序方法的建立及在水稻基因测序中的应用［Ｊ】．中国水稻科学（ＣｈｉｎｅｓｅＪＲｉｃｅＳｃｉ），２００５，１９（５）：４６３－４６６．【１１２】龚平，孙铁珩，李培军．农药对十壤微生物的生态效应［Ｊ】．应用生态学报．１９９６，７（ｓｕｐ．）：１２７．１３２．［１１３］黄耀蓉，李登煜，张小平．ＰＣＰ—Ｎａ污染土壤的微生物活性及优势荫群研究【Ｊ】．两南农业学报，１９９９，１２（１）：３９—４３．【１１４】严昶升，周礼恺，张德生．十壤肥力研究法【Ｍ］一匕京：农、Ｊｋ出版社，１９８８．４９微生物学硕ｌｊ论丈五氯酚对十壤微生物区系影响及其降解荫的筛选ｒ●Ｌ１５１ｊ周礼恺，张志明，陈恩风．黑土的酶活性【Ｊ】．土壤学报，１９８１，１８（２）：１５８—１６５．万忠梅，吴景贵．土壤酶活性影响冈子研究进展【Ｊ】．两北农林科技人学学报（自然科学版）．２００５，３３（６）：２１－２６．ｒ●Ｌｌ６１Ｊｒ●Ｌｌｌ７１Ｊ任艳红，徐向阳，唐全．降解ＰＣＰ厌氧生物反应器微生物种群结构的分子特性研究【Ｊ】－环境科学学报，２００５，２５（２）：２１４—２１９．ｒ●Ｌｌｌ８１Ｊ郑永良，陈舒丽，刘德立．土壤中降解农药微生物的类别及降解特性【Ｊ】．黄冈师范学院学报，２００５，２５（３）：１１．１６．ｒ．Ｌｌｌ９１】Ｂ．Ｃ．ＯＫＥＫＥ，Ｊ．Ｅ．ＳＭＩＴＨｅｔａ１．ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｉｎｓｏｉｌｂｙｏｆｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｄｏｄｅｓａｎｄｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｎｐｅｎｔａｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＬｅｎｔｉｎｕｌａＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６４５：２６３・２６６．