干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径

干货外泌体的提取储存、临床应用和给药途径

摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外小囊泡，携带核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质，在机体的生理病理过程中发挥作用。与脂质体、纳米颗粒等合成载体相比，外泌体的内源性和异质性使其在疾病诊断和治疗领域具有广泛而独特的优势。

直径约 40-100nm 的外泌体是由细胞分泌的生物纳米级球形脂质双层囊泡，以 1.13-1.19 g ∙ mL-1 的密度漂浮在梯度溶液中。1981 年，科学家Trams 等将质膜来源的囊泡统称为外泌体，并首次提出了“外泌体”的概念，将其视为具有 5'-核苷酸酶活性的膜囊泡，可能具有生理功能，起源于各种细胞系培养物的分泌物。

外泌体 Exosomes

目前定义的外泌体（40-100nm）于 1983年 首次在绵羊网织红细胞中发现，科学家Johnstone 等人追踪了网织红细胞成熟过程中的转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白受体丢失的机制细胞。为了将它们与其他类型的细胞外囊泡 (EV) 区分开来，它们被命名为外泌体。

然而，值得注意的是，根据 ISEV 2018 指南，“外泌体”一词即使被广泛使用，也被建议替换为“小细胞外囊泡 (sEVs)”一词，由于分离方法上的困难。研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体等生物活性物质。其中，外泌体蛋白成分主要分为两类，一类是公共成分，参与这一过程囊泡的形成和分泌，即外泌体无处不在，包括膜转运和融合相关蛋白（如 Rab、GTPases）、热休克蛋白（如 HSP70、HSP90）、四跨膜蛋白超家族（如 CD63、CD81）、 ESCRT 复合物相关蛋白（如 Tsg101、Alix）、整合素等；另一种是特异性成分，与其祖细胞密切相关，即细胞特异性，如抗原呈递细胞来源的CD45和MHC-II。

随着外泌体研究的深入，其应用越来越广泛。外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，充当细胞间通讯和物质交换的介质。同时，外泌体可以通过多种途径和位点递送多种生物活性物质和易失活或易降解的成分（指单独给药时在体内停留时间短的治疗剂），并安全转移。

外泌体的提取制备

随着外泌体研究的深入，其潜在应用价值不断被挖掘。外泌体的可重复分离和富集将有助于评估其生物学功能。然而，外泌体在大小、含量、功能和来源方面是异质的，这使得分离变得困难。此外，目前大多数分离技术无法将外泌体与具有相似生物物理特性的脂蛋白和来自非内体途径的细胞外囊泡完全分离，导致外泌体纯度较低。因此，如何高效富集外泌体是当前的一大课题，对于外泌体的下游分析至关重要。针对不同的目的和应用，选择不同的分离方法，其中更常用的是超速离心、基于尺寸的分离技术、聚合物沉淀、免疫亲和捕获技术。

超速离心技术

超速离心 (UC) 是目前应用最广泛的分离技术，也被称为外泌体提取和分离的金标准。UC 主要根据原溶液中各组分的大小和密度差异来收获所需组分，因此适用于沉降系数差异显着的大剂量样品组分的分离。 科学家Johnstone 等人首次将该方法应用于在网织红细胞组织培养基中分离外泌体，并由 Thery 等人优化方法。超速离心主要分为两个步骤：首先，一系列连续低中速离心去除死细胞、细胞碎片和大尺寸的细胞外囊泡，然后以100,000×g的离心力以更高的速度分离外泌体，用PBS洗涤外泌体以去除污染蛋白质等杂质。研究发现离心时间、离心力、转子类型和参数都会影响目标外泌体的产量和纯度。这种方法不需要标记外泌体，可以避免交叉污染，但不利于下游由于其耗时、成本高、结构损坏、聚集成块和脂蛋白共分离而进行分析。

聚合物沉淀法

聚合物沉淀法通常以聚乙二醇（PEG）为介质，通过降低外泌体的溶解度，在离心条件下收获外泌体。这种方法最初用于分离病毒。由于外泌体和病毒具有相似的生物物理特性，因此在科学研究中经常使用这种方法来分离和纯化外泌体。比较超速离心、改性聚合物共沉淀 (ExtraPEG) 和市售的商业试剂盒三种技术，发现前两种方法优于商业试剂盒，并且 ExtraPEG 更具成本效益，在以下方面优于超速离心纯度和回收率。聚合物沉淀法操作相对简单，分析时间短，适合处理大剂量样品。但纯度和回收率较低，容易产生假阳性，产生的聚合物难以去除，不利于后续的功能实验分析。

基于尺寸的隔离技术——超滤方法

该技术主要是指超滤和尺寸排阻色谱，根据外泌体与生物样品中其他成分的大小差异进行分离。

尺寸排阻色谱（SEC）的分离原理是大分子不能进入凝胶孔，它们与流动相沿着多孔凝胶之间的间隙被洗脱，而小分子留在凝胶孔中并最终被洗脱通过流动相。目前，基于SEC原理的qEV分离柱、EVSecond纯化柱、Exo-spin外泌体纯化柱已上市。SEC 的应用快速、简单且成本低。分离出来的外泌体结构完整，大小均匀，其生物学特性不会受到显着不利影响，但可能掺杂其他类似大小的颗粒，导致纯度降低。

超滤方法通常使用具有不同截留分子量（MWCO）的超滤膜来选择性分离样品。这种方法的使用率约为 20%,56，在外泌体研究中经常起到辅助分离的作用。超滤法通常使用超滤管分离外泌体，成本低，富集效率高，且不影响外泌体的活性。然而，外泌体和超滤膜的纯度低和非特异性结合会降低回收率。

免疫亲和色谱 (IAC)

免疫亲和层析是一种基于抗体和配体特异性结合的分离纯化技术，可将所需物质从异质混合物中分离出来。结合效率与生物亲和对、洗脱条件和基质载体密切相关。原则上，该方法应用的生物标志物（抗原）应该是外泌体膜表面的高丰度蛋白，如四跨膜蛋白超家族、ESCRT复合物相关蛋白等。当然，靶蛋白可以是外泌体表面的一种常见成分，也可以是促进IAC识别特定细胞来源外泌体的独特成分。与超速离心相比，IAC 可以用更少的样品量产生类似的结果。它还可以用于外泌体的定性和定量测定。特异性强、灵敏度高、纯度高、产量高，基于磁珠时不设定起始样品量的上限。例如，基于微孔板的酶联免疫吸附分析技术用于富集血清、血浆和尿液等体液中的外泌体。定量检测分析发现，该方法收获的外泌体产量与超速离心相当，但对样品的需求量要小得多。从400 μL血浆中提取的RNA量与2.5mL样品超速离心得到的量相同，因此比超速离心有一定优势。然而，免疫亲和层析得到的外泌体的储存条件相对苛刻，不适合用于外泌体的大规模分离。基质的非特异性干扰吸附会产生干扰蛋白，使该方法难以推广。

其他技术

目前市场上有多种基于上述传统分离技术的商业试剂盒，如exoEasy Maxi kit (QIAGEN)、MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS (Wako)和Minute™ Hi-Efficiency Exosome Precipitation Reagent (Invent)。综合分析表明，该商品化试剂盒具有省时、产量高、完整性好等优点。但是，由于目前市售的外泌体提取试剂盒提取效果不均，目前还没有试剂盒能够从样品混合物中分离出理想的外泌体。同时，试剂盒本身价格昂贵，外泌体的产率和纯度不高。但随着外泌体分离纯化技术的不断探索、发展和创新，越来越多的新方法可供研究人员从一个或多个角度优化传统技术，具有潜在的应用价值。

外泌体的储存

外泌体是一种很有前途的无细胞疗法，但它们不能长期储存。因此，有必要研究外泌体的保存技术，以保护其生物学活性，方便运输和临床应用。目前，应用的保护技术主要有冷冻、冷冻干燥和喷雾干燥。

冷冻保存

冷冻保存是一种将温度降低到生化反应所需温度以下以维持生物颗粒功能稳定性的储存方法，通常在4℃、-80℃和-196℃的温度下应用。但是，这种存放方式容易出现“冻伤”。这里所说的“冻伤”，多与冷冻过程中渗透不平衡以及生物颗粒内部形成冰晶有关。为了克服这一缺陷，通常有选择地添加一种或多种适当浓度的防冻剂以延长保质期。

防冻液通常分为渗透性和非渗透性两种。其中，渗透性防冻液分子量小，能穿透细胞膜进入细胞内，防止冰晶的形成，如二甲基亚砜、乙二醇等。研究表明，从形态学角度来

看，直接冷冻会影响外泌体膜的稳定性并促进其降解，而冷冻保存中添加DMSO的外泌体与新鲜外泌体相似。此外，在生物活性方面，短期冷冻保存（2 个月内）并没有显着改变外泌体的功能。非渗透性防冻剂可以与水形成氢键，通常是海藻糖、蔗糖等碳水化合物。糖通过磷脂头基和糖的OH部分之间的相互作用取代了脂质头基周围的水分子。糖的玻璃基质可以防止囊泡聚集，减少冰晶造成的伤害。考虑到安全性，双糖防冻剂是外泌体的最佳选择，其中海藻糖被列为最有效的双糖防冻剂。值得注意的是，使用前应检查防冻液的适当浓度，以保持平衡状态，防止不必要的伤害。

冷冻干燥保存

冷冻干燥是将含有水分的物料预先冷却并在冰点以下冻结成固体，在真空下直接使冰升华并以水蒸气的形式除去，从而满足储存要求的技术。冷冻干燥技术主要分为三个阶段：预冻阶段、升华干燥阶段和分析干燥阶段。冻干外泌体冻干粉可有效降低储存条件。由于它在低温、真空条件下完成产品的脱水干燥，可以保持其原有的活性，减少对生物组织和细胞体的损伤。该材料可以很容易地保持在一个恒定的可储存状态，并且可以通过简单地加水来复原。它是保存热敏材料（如 EV、疫苗和蛋白质）的合适方法。

在冷冻干燥过程中，由于产生的冷冻和脱水压力，生物分子的分子结构可能被破坏。因此，还需要选择性地添加防冻剂来保护生物材料。 科学家Charoenviriyakul 等人将 B16BL6 黑色素瘤的外泌体分成三份，一份保存在-80°C，一份加入海藻糖冷冻干燥，一份直接冷冻干燥，并比较外泌体的形态、蛋白质含量和对药代动力学的影响。结果表明，海藻糖的加入可有效防止冻干过程中外泌体的聚集，增加其胶体稳定性，且不会改变外泌体的形态。冻干外泌体在室温下保存的蛋白质含量与-80°C时相似，对药代动力学的影响很小。

喷雾干燥

喷雾干燥是一种系统地应用于材料干燥的技术。EVs溶液在干燥室雾化后，水分与热空气接触迅速蒸发，得到干粉。在此过程中，雾化压力和出口温度是影响外泌体稳定性的因素。与冻干相比，喷雾干燥是一个连续的过程，可以实现一步研磨，更经济，可膨胀，可以调整产品的粒度。

迄今为止，最好的综合贮藏方式是-80℃冷冻贮藏。然而，不同的来源和不同的实验技术都会影响外泌体长期储存稳定性的温度选择。研究发现，与新鲜提取的外泌体相比，-80 °C 下储存 4 天会改变外泌体的形态，-80 °C 下储存 28 天时外泌体的生物活性会降低。同时，一些研究表明，乳源性外泌体在-80°C 下储存 4 周，物理性质没有任何变化，紫杉醇的负载率也保持稳定。因此，研究储存稳定性迫在眉睫。从多个角度分析外泌体，尤其是长期稳定性。比如从来源、给药途径、应用技术和未来研究方向等方面。总之，有利于开展外泌体的后续功能研究，缩短实验过程，扩大其应用范围。

外泌体的应用

疾病诊断

外泌体富含用于疾病诊断和预后的生物标志物。它们主要应用于癌症，在心血管疾病、肺结核和中枢神经系统疾病领域也取得了一些进展。与心血管疾病相关的外泌体 microRNAs 水平，包括 miR-499、miR-133、miR-208、miR-192、miR-194、miRNA-34a 在急性心肌梗死和心力衰竭患者中上调，85-88这为其用作诊断标记物提供了强有力的基础。据悉，Dysferlinopathy是一种由于缺乏dysferlin而引起的疾病，该病患者血清和尿液中外泌体的诊断能力，发现患者的外泌体中没有dysferlin，可以与正常

人区分开来用于Dysferlinopathy的诊断。外泌体中的 MiR-21、miR-29、miR-219、LRP6、REST1、caveolin1 在中枢神经系统疾病中差异表达，显示出良好的临床诊断潜力。

通过外泌体靶向给药系统治疗疾病

外泌体体积小，可有效避免单核巨噬细胞的吞噬作用，可自由穿过血管壁和细胞外基质。CD55和CD59在其表面的表达避免了调理素和凝血因子的激活，因此可以在生物体液中广泛分布和稳定。与体外合成的脂质体等纳米给药系统相比，外泌体来源于人体，理论上具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。事实上，由于外泌体的异质性，它们的表面携带着各种蛋白质，与细胞接触后以多种方式进入细胞。其中，受体介导的内吞作用是外泌体与靶组织进行信息交流的主要方式之一，它优化了外泌体的内吞过程，促进了包封药物的内化，有利于血液中内容物的持续稳定转运。运输效率高。此外，外泌体具有很强的归巢靶组织或细胞的能力，穿透生物屏障（如血脑屏障），因此具有天然药物递送的优势，是很有前景的靶向药物载体，可用于递送基因药物，中药、西药等。然而，天然外泌体可能存在靶向性弱、易在体内快速清除等问题，导致治疗效果不佳。此时，它们通常被修饰以形成工程外泌体。工程外泌体是指装载有治疗剂或经过修饰的天然外泌体。下面主要从载药量和表面修饰的角度解释外泌体靶向递送系统的应用。

西药是外泌体作为药物载体传递的治疗剂之一，可以在癌症、炎症等多种病理过程中发挥作用。长期以来，癌症的死亡率居高不下，开发高效的癌症治疗策略是国内外研究团队的目标。阿霉素是一种两亲性药物，可以抑制血管生成，控制肿瘤生长，起到治疗作用。属于广谱抗肿瘤药物。 研究人员使用斑马鱼模型来检查脑内皮衍生的外泌体通过血脑屏障递送抗肿瘤药物多柔比星的功效。图像显示，外泌体成功地将药物装载穿过血脑屏障，可以显着抑制肿瘤的生长，证实外泌体可以作为载体。此外，卟啉、100替拉扎明、101多西紫杉醇和顺铂等抗癌药物也可以通过外泌体发挥作用。

中成药，包括单体活性成分和复方制剂，由于其低毒副作用而被广泛应用于外泌体递送系统的研究。

虽然紫杉醇 (PTX) 是一种广泛使用的抗肿瘤药物，可以在多种恶性肿瘤中发挥治疗作用，但它是一种高度疏水的化合物，具有剂量依赖性毒副作用，因此其临床应用受到限制。最近，已经广泛报道了使用外泌体递送 PTX 来解决这种缺陷的研究。例如，研究人员选择经典的活化 M1 型巨噬细胞来源的外泌体作为载体，以降低 PTX 的毒性并提高其生物利用度。PTX不仅已成功递送至小鼠的肿瘤组织，而且通过激活NF-κB通路建立促炎环境以增强PTX的治疗效果。

姜黄素是一种亲脂多酚化合物。其溶解度低、稳定性差、代谢快、半衰期短等缺陷导致生物利用度较低，限制了其在疾病治疗中的应用。 研究人员 将姜黄素加载到外泌体上形成复合物，通过提高姜黄素的溶解性、稳定性和生物利用度来增强其抗炎活性。用这种复合物治疗的小鼠能够抵抗脂多糖 (LPS) 诱导的感染性休克。此外，姜黄素还具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用。

载有浆果花青素的外泌体对卵巢癌细胞的增殖具有良好的抑制活性。载有梓醇的外泌体可起到神经保护作用。载有β-榄香烯的外泌体可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，对卵巢癌细胞的增殖也有一定的改善。此外，外泌体还可装载雷公藤内酯114或中药复方补阳还五汤，以弥补单一给药的不足，增强治疗效果。

外泌体还可以传递基因治疗剂，如 DNA 和 RNA，并采用基因治疗策略。例如，寡核苷酸可以沉默特定基因以治疗多种人类疾病，包括癌症或神经退行性疾病。寡核苷酸剂 (ONT) 是一种通过靶向 RNA 或 DNA 来阻止导致疾病表型的蛋白质表达的新药，例如将装载有疏水性 siRNA (hsiRNA) 的外泌体递送至大脑，是一种有效的治疗方法。亨廷顿病

和其他神经退行性疾病。同样，外泌体可以携带治疗性RNA靶向细胞，例如将外源siRNA靶向人血细胞中的单核细胞和淋巴细胞，可以导致MAPK1基因选择性沉默。

外泌体的给药途径

外泌体给药系统有多种给药途径，其中常见的给药途径包括静脉注射、皮下注射、腹腔注射、瘤内注射、鼻内给药和口服给药。本质上，给药途径密切与各种疾病的治疗效果有关，给药途径的不同也影响药物在体内的生物分布和快速清除率。因此，有必要研究外泌体给药系统途径的影响。

结论与展望

与脂质体、纳米粒、微球、微乳等合成载药系统相比，外泌体的内生性是天然的独特优势。外泌体的优越性使其成为细胞间通讯的重要媒介，在调节正常生命活动和疾病诊治方面发挥着独特的生物学功能。外泌体作为当前的研究热点，受到国内外研究人员的广泛关注。然而，以外泌体含量为标志物进行疾病诊断和预后的检测技术尚未完善。外泌体能否尽快应用于临床，很大程度上取决于优化和改善现有外泌体问题的结果。如何提高外泌体的产量和纯度是重中之重，一直是限制其转化应用的瓶颈。近年来的研究表明，将几种提取纯化外泌体的方法适当结合可以有效改善上述问题，而如何将它们结合起来达到最佳效果还有待进一步研究。其次，外泌体的分泌机制和融合机制尚不清楚。外泌体异质性对载药效率的影响需要进一步揭示。外泌体负载能力和增强靶向的方法也需要优化和改进。开展全方位、多领域的研究，分析其生物学功能，为后续的药代动力学、毒理学研究和临床试验奠定基础，有助于今后更好地了解机体状态和诊治疾病。

参考文献：

Stremersch S, Vandenbroucke RE, Van Wonterghem E, Hendrix A, De Smedt SC, Raemdonck K. Comparing exosome-like vesicles with liposomes for the functional cellular

delivery

of

small

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