填髓益脑法对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

・１７８２・　中国中医急症２０１１年１１月第２０卷第１１期　ＪＥＴＣＭ．Ｎｏｖ．２０１１，Ｖｏ１．２０，Ｎｏ．１１　・实验研究・　填髓益脑法对大鼠脑缺血再灌注损伤后细胞　凋亡的影响　丁　念　张觉人　湖北省武汉市中医医院（湖北武汉４３００１４）　中图分类号：Ｒ２８５．５文献标志码：Ａ文章编号：１００４—７４５Ｘ（２０１１）１１－１７８２—０２　【摘要】　目的探讨填髓益脑法对脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。方法采用线栓法建立大鼠大脑中　动脉阻塞（ＭＣＡＯ）模型，填髓益脑组按６０ｇ／ｋｇ灌胃填髓益脑汤；采用Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ双染色法观测缺血侧　齿状回区细胞凋亡的阳性数目。结果填髓益脑法对缺血性大鼠细胞凋亡数目明显少于对照组。结论填髓益　脑法在急性脑缺血再灌注实验中可以减少再灌注损伤后出现的细胞凋亡。　【关键词】脑缺血再灌注填髓益脑法Ｈｅｏｃｈｓｔ细胞凋亡　胞。在光镜下２００倍放大，通过图像分析系统在每张切片上随机　选取５个非重叠视野．正常细胞为低蓝光／低红光，凋亡细胞为　中医学认为，缺血性中风病机多由脑之脉络瘀塞，损伤脑之　神机而成ｉｔ］，多采用化瘀通络法治疗。而本课题组认为，脑髓空　虚、髓海不足是缺血性巾风另一证型．并采用填髓益脑法治疗临　高蓝光／低红光，坏死细胞为低蓝光／高红光，测定阳性染色的平　均光密度与阳性细胞百分比．计算脑神经细胞凋亡指数（ｎｉ）：　ＡＩ＝平均光密度Ｘ（凋亡阳性细胞数／总神经细胞数）ＭＯＯ。　１．６统计学处理采用ＳＰｓＳ统计软件。数据以（　±ｓ）表示，采　用ｔ检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　２结　果　床上取得了较为满意的效果　Ｊ。本课题前期研究填髓益脑法治　疗缺血性巾风的作用机制，町能是通过阻止脑组织ＳＯＤ活性降　低、减少ＧＩ　Ｕ的释放、降低ＮＯ含量而发挥神经保护作用［４ｊ，可　以促进脑缺血再灌注注神经干细胞的增殖　。最近研究表明，缺　血性脑组织损伤有两种形式：缺血性坏死和凋　。本实验采用　Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ双染色法观测了缺血侧齿状回区的细胞凋亡．　见图１．表１。采用Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ双染色法观测缺血侧齿　状回区细胞凋亡的阳性数目．假手术组只见少量凋亡细胞，模型　组凋亡细胞明显增多，填髓益脑组凋亡细胞明显减少。　以进一步探讨填髓益脑法对脑组织的保护作用。　１材料与方法　１．１　实验动物　雄性ＳＤ大鼠，ＳＰＦ级．体质量２５０～２８０ｇ，华中　科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物合格证号为　２００４０７。　１．２药物与试剂　填髓益脑汤（枸杞１０ｇ，菊花１２ｇ，熟地黄９ｇ，　山药９ｇ，山茱萸肉９ｇ，茯苓９ｇ，牡丹皮９ｇ，泽泻９ｇ，女贞子９ｇ，　墨旱莲９ｇ，桑椹子９ｇ，首乌９ｇ，白蒺藜９ｇ）于湖北省药材公司药　店购得饮片，经武汉市巾医院药剂科鉴定并制备。采取水煎醇沉　法，制备填髓益脑汤水煎液（生药含量为５ｇ］ｍＬ）于４℃保存备　＿　模型组　假手术组　填髓益脑组　图１造模组中大鼠缺血侧齿状回区凋亡细胞的表达（ｘ２００）　表１各组大鼠缺血侧齿状回区细胞凋亡比较（％，　）　用。Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ染色剂．南京建成生物有限公司：其余药品　和试剂均为市售分析纯　１＿３分组与方法动物分为假手术组，对照组，填髓益脑组，每　与模型组比较，▲Ｐ＜０．叭；与假手术组比较，△Ｐ＜０．０１。　组８只。填髓益脑组按６０ｇ／ｋｇ灌胃填髓益脑汤，假手术组和对　照组分别以等量０．９％氯化钠注射液１ｍＬ／ｋｇ灌胃。连续给药７ｄ．　于最后１次给药后３０ｍｉｎ实施脑缺血再灌注手术。　１．４模型制备大鼠大脑巾动脉栓塞（ＭＣＡＯ）及再灌注模型组　制备：本实验采用改良Ｚｅａ　Ｌａｎｇａ法　制作可逆性大脑中动脉线　栓法。手术后无肢体活动障碍或昏迷者示造模失败，弃之不用。　假手术组栓线插入深度在１５ｍＩｌｌ以内，此深度不足以阻断大脑　３讨论　近年来细胞凋亡在脑缺血损伤中的作用日益受重视。研究　认为０　，无论是急性的局灶性脑缺血．还是短暂性脑缺血后的迟　发性神经元死亡，都有神经细胞凋亡的参与，而且凋亡在迟发性　神经元死亡和半暗带的扩大中具有重要作用；新近研究提示：在　半暗带恶化过程中．神经细胞死亡及由此导致的不可逆性损伤　病灶的进一步扩大，可能主要是通过细胞调亡来实现的。　本实验采用采用Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ双染色法观测缺血侧齿　中动脉，手术后无肢体活动障碍或昏迷。　１．５标本采集与检测　细胞凋亡阳性细胞数测定：取缺血侧齿　状回区组织，采＿Ｈｊ　Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ双染色法，染色程序按　Ｈｅｏｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ双染色法操作常规进行．观察并计数阳性细　状回区细胞凋亡的阳性数目。从结果看来，假手术组只见少量凋　中国中医急症２０１１年ｌ１月第２Ｏ卷第１１期　ＪＥＴＣＭ．Ｎｏｖ．２０１１，Ｖｏ１．２０，Ｎｏ．１１　・１７８３・　亡细胞，模型组凋亡细胞明显增多，填髓益脑组凋亡细胞明显减　少。填髓益脑法对大鼠缺血侧齿状回区细胞闶亡数目明显少于　造模组，不难推测填髓益脑法可以抑制神经细胞凋亡从而起到　神经保护作用。　中医药在降低脑血管疾病的致残率，提高神经功能方面有　着较好的疗效。填髓益脑方中首乌、枸杞、熟地黄、山药、山茱萸　肉填髓益脑皆为君药。女贞子、墨旱莲、桑椹子滋补肝肾养阴皆　为臣药；茯苓、牡丹皮、泽泻以泄虚火制亢阳皆为佐药，菊花、白　蒺藜归肝经上行于脑为使药。诸药共奏滋阴填髓益脑使髓海得　充、亢阳得制，故切中病机。　据研究表明．卵磷脂是脑髓的主要成分．而首乌含有相当高　１９９７　１　ｌ２６－１２８．　［２］张觉人．脑梗塞治验两则［Ｊ］．中医杂志，２００２，（６）：４２４．　［３］张觉人，杨庆堂．脑病填髓四法［Ｊ］．辽宁中医杂志，２００４，３１（１０）：　８４０．　［４］张觉人，张压西，丁念，等．填髓益脑法对大鼠脑缺血再灌注损伤　的保护作用［Ｊ］．中国中医急症，２００７，１６（８）：９６９—９７０．　［５］　丁念，张觉人．填髓益脑法对大鼠脑缺血再灌注增殖细胞核抗原　表达的实验研究［Ｊ］．中国中医急症，２００９，１８（８）：１３０１．　［６］Ｓａｖｉｏ　Ｍ，Ｓｔｉｖａｌａ　ＬＡ，Ｂｉａｎｃｈｉ　Ｌ，ｅｔ　ａ１．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）ｉｎ　ＤＮＡ　ｒｅｐａｉｒ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｌｋｙｌａａｔｉｎｇ　ａ—　ｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，　１９９８，１９（４）：５９１—５９６．　的卵磷脂，达到３．７％；枸杞能明显降低＾ｙ射线造成的微核水平，　且能提高紫外线照射后的ＤＮＡ受损后的修复能力。熟地黄可以　调节脑谷氨酸（Ｇｌｕ）和　氨基丁酸（ＧＡＢＡ）含量，提高ＭＳＧ大鼠　Ｎ一甲基Ｄ一门冬氨酸受体１（ＮＭＤＡＲ１），ＧＡＢＡ受体在海马的表　达，提示其具有明显的健脑益智作用。茯苓水提液具有拮抗谷氨　［７］Ｋｅｒｒ　Ｊ　Ｆ，Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ　Ｈ，Ｃｕｒｒｉｅ　Ａ　Ｒ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａ　ｂａｓｉｃ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｈｅ－　ｎｏｍｅｎｏｎｗｉｔｈｗｉｄｅ　ｒａｎｇｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｉｓｓｕｅＫｉｎｅｔｉｃｓ［Ｊ］．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，　１９７２，２６（６）：２３９．　［８］　Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ　Ｋ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ　Ｔ，Ｋｉｔａｇａｗａ　Ｋ，ｅｔ　ａ１．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂｃｌ一２　ｆａｍｉｌｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐｒｅｃｅｄｅ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ　ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｅｎｕｍｂｒａ，ｂｕｔ　酸的升高胞浆内钙离子浓度的作用，提示茯苓可能对由谷氨酸　造成的神经细胞损伤有抑制作用。　由于脑缺血再灌注损伤机制复杂，以及中药复方多成分、多　靶点的特点．填髓益脑法对减少脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡　的机制有待进一步深入研究。　参考文献　ｎｏｔ　ｉｎ　ｉｎｆａｒｃｔ　ｃｅｎｔｒｅｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｌｏｃａｌ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１９９８，８３（２）：４３９—４４８．　［９］张军建，阮旭中，张苏明，等．大鼠局灶性脑缺血再灌流半暗带神　经细胞坏死与凋亡的动态变化［Ｊ］．基础研究，１９９９，１８（３）：１７０—　１７３。　［１０］王新志，韩群英，郭学芳．中风脑病诊疗全书［Ｍ］．中国医药科技出　版社，２０００：３０—３２．　［１］张学文．近代中医名家论中风病荟萃［Ｍ］．西安：陕西科技出版社　（收稿日期２０１ｌ一０５—２６）　（上接第１７８ｌ页）　２．４　当归拈痛汤加味膏剂对大鼠血清ＴＮＦ—ｄ、ＩＬ一１７的影响　各组间分别进行单因素方差分析，４组间有统计学意义，组间进　行ＬＣＤ检验（结果见表３），佐剂性关节炎大鼠血清ＴＮＦ一　、ＩＬ一　１７水平均高于空白组（Ｐ＜０．０５）；经甲氨蝶呤＋当归拈痛汤加味　膏剂治疗后，甲氨蝶呤＋当归拈痛汤加味膏剂组的ＴＮＦ一仅、ＩＬ一　１７水平低于模型组（Ｐ＜０．０５），甲氨蝶呤＋双氯芬酸二乙胺乳组　的ＴＮＦ—Ｏ／．、ＩＬ一１７水平低于模型组（尸＜０．０５），甲氨蝶呤＋当归拈　痛汤加昧膏剂组的ＴＮＦ—　、ＩＬ一１７水平略高于甲氨蝶呤＋双氯芬　酸二乙胺乳组（Ｐ＜０．０５）。　表４各组ＴＮＦ—Ｏｔ、ＩＬ－１７水平比较（ｎｇ／ｍＬ，ｘ￣ｓ）　胞凋亡不足导致关节滑膜细胞过度增生，在炎症起始阶段，滑膜　细胞增殖信号尚未启动，但细胞的抗凋亡机制启动，并伴随滑膜　细胞活化而分泌大量的促炎性细胞因子，炎症因子进一步促进　炎症细胞的聚集及滑膜细胞的增殖，故诱导滑膜细胞凋亡对治　疗类风湿性关节炎有积极意义。本实验中，治疗组可显著抑制足　跖肿胀程度，并提高滑膜细胞的凋亡率，降低大鼠血清中ＩＬ一　１７、ＴＮＦ—　的水平，抑制免疫性炎症，恢复异常的免疫调节功　能．与模型组比较有较大改善，与对照组效果相当。揭示了当归　拈痛汤加味膏剂清热利湿，祛风止痛治疗ＲＡ的作用机制可能　与其提高滑膜细胞的凋亡率以及抑制炎症因子（ＩＬ一１７、ＴＮＦ一仅）　有关。　参考文献　『１］辛小红，安莉萍．当归拈痛汤对佐剂性关节炎大鼠抗炎镇痛作用［Ｊ］．　中外健康文摘，２００８．４：６６—６８．　［２］　马玉琛．弗氏完全佐剂制备大鼠类风湿性关节炎模型［Ｊ］．现代预防　医学，２００８，３５（１０）：１９８９—１９９１．　与空白组比较，　Ｐ＜０．０５；与模型组比较，ＡＰ＜０．０５。　『３］陈利锋，潘立文．益气活血法对ＡＡ大鼠滑膜细胞凋亡及血清细胞　因子的影响『Ｊ］．湖北中医学院学报，２０１０，１２（１２）：３－５．　『４］李践，徐宝林，张文娟．克痹汤抗炎镇痛及免疫调节作用的实验研　３讨论　当归拈痛汤加味膏剂在金代名医张元素的《医学启源》当归　拈痛汤的基础上加味组成，当归拈痛汤素有“湿热疼痛之圣方”　之美名，张氏用药法式有系统，有规矩，有组织，秩序井然，颇具　究［Ｊ］．中国中医药科技，２００６，１３（３）：１５３—１５４．　［５］卢毓雄，于哗等．益肾蠲痹丸与布洛芬合用治疗佐剂性关节炎模　型大鼠的实验研究［Ｊ１．中国中医基础医学杂志，２００６，１２（７）：　５１３—５１４．　特色，自成家法。纵观当归拈痛汤加味膏剂全方，有清热利湿，祛　风止痛之功效，其现代药理学意义在于其抗炎解热镇痛的效应，　故适用于风湿热痹早期的ＲＡ患者。　［６］Ｅｄｗａ￣Ｄ，Ｈａｒｒｉｓ　Ｊｒ．凯利风湿病学［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，　２００６：８６８—８６９．　滑膜细胞凋亡减少是ＲＡ发病的主要机制之一＿７］，滑膜细　（收稿日期２０１１—０８—０３）