DNA疫苗的研究进展

青海畜牧兽医杂志

ChineseQinghaiJournalofAnimalandVeterinarySciences

40卷4期Vo.l40,No.4

DNA疫苗的研究进展

朵 红

(青海省畜牧兽医科学院,西宁,810016)

摘 要:本文从DNA疫苗的研究历史,构建,免疫途径,免疫机理及优缺点等方面的研究进展进行了综述。

关键词:DNA疫苗;研究进展

中图分类号:S859.79 文献标识码:B 文章编号:100327950(2010)0420045202 核酸疫苗(nucleicacidvaccine)是指将含有编码某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组后直接导入动物细胞内,并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。它包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究最多的是DNA疫苗。DNA疫苗经直接接种体内后,可被体细胞摄取,并转录、翻译、表达,然后通过不同途径刺激机体产生应答。由于DNA疫苗既拥有亚单位疫苗和灭活疫苗的安全性,又兼备减毒疫苗或重组疫苗才有的诱导细胞免疫应答的特点,因而受到越来越多的重视,是近年来备受人们关注的一种新型疫苗112。1 研究历史

DNA疫苗的发现和研究始于Wolff等122(1990年)在一次基因治疗实验研究中的意外发现。他们在小鼠肌肉组织内直接注射质粒DNA后,质粒及其携带的外源基因可被小鼠肌细胞吸收,并能在体内诱导产生至少维持2个月的抗体。1991年Williams等132通过氦驱动的以包被有DNA的微粒轰击鼠肌和鼠肝脏,发现编码的基因在两种组织中的表达存在达14d以上。Tang等142(1992年)将表达人生长激素(hGH)及A抗胰蛋白酶(AAT)基因的表达质粒皮肤接种小鼠,免疫后2周用放射免疫法蛋白印迹检测到相应的抗体,加强注射后,特异性抗体可在体内持续4个多月。Ulmer等152(1993年)将含流感病毒核心蛋白编码基因的质粒载体直接注入小鼠肌肉,使小鼠产生了对该病的免疫保护。Robinson等162(1993年),将编码流感病毒HA糖蛋白基因合适质粒通过肌肉注射的方法能够诱导特异的抗体反应,保护机体免受同源的流感病毒的侵袭。2 DNA疫苗的构建

用把目的抗原的编码基因插入载体质粒的方法构建DNA疫苗,用做DNA疫苗的表达载体必须具备以下特点:¹含有真核细胞启动子,在哺乳动物细胞内能高水平表达目的基因;º本身不复制;»不会整合到宿主染色体中。目前常用的表达载体包括:质粒表达载体、缺陷性病毒表达载体等。DNA疫苗由目的基因和质粒载体两部分组成。其目的基因通常选择该病毒的主要保护性抗原基因,最好是可对多数毒株都有保护作用的抗原基因。抗原基因可以是单个基因或具有协同保护功能的一组基因,也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列,质粒载体必须能在原核及真核表达系统中高效表达,但不复制,且不含有向宿主细胞基因组内整合的序列172。3 DNA疫苗的免疫途径

常用的接种方法有三种:第一种是用生理盐水稀释质粒DNA,直接肌肉注射;第二种是用高速轰击提高疫苗DNA对组织的转染率和表达效率,即用DNA包裹金颗粒,用基因枪射入组织,称为/微粒轰击法0;第三种是将组织预先用药物如丁哌卡因、心肌毒素和高渗蔗糖等进行处理,以增加组织细胞对疫苗DNA的摄取和表达能力,称为/药物协助法0182。不同剂量的质粒DNA注入到宿主靶细胞的表现也可能不同。使用基因枪射入的质粒包裹在金颗粒上,DNA的降解最少,而且直接传递到体细胞和抗原递呈细胞(APCs)的靶细胞上。不同的接种

¹收稿日期:2010205204

方式如使用栓剂、无针注射系统、体内电穿孔方法、黏膜传递系统等,会对疫苗的效力产生不同的影响。此外,静脉途径、黏膜途径、肌肉途径、外科手术直视下肝脏途径和皮肤途径,腹腔、直肠以及阴道等免疫途径亦有报道192。4 DNA疫苗的免疫机理

当疫苗的质粒DNA被导入机体后,可被机体细胞所摄取,被摄取的质粒DNA分子在特定的启动子作用下,即可在细胞核内转录为mRNA后,再被移至细胞质内翻译成抗原蛋白分子,表达的抗原蛋白分子诱导机体产生免疫反应,所合成的抗原蛋白类似于亚单位疫苗,他们之间的区别在于基因疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生。

DNA疫苗的免疫机理目前尚不十分清楚,就最近的研究资料,可以将核酸疫苗的免疫机理概括为3个方面:第一是DNA疫苗接种后,在非淋巴系统的组织细胞,如肌细胞内表达抗原,再被分泌或被损伤的细胞释放到组织间隙,最终被结合在游离核糖体上的mRNA翻译而表达,合成的内源性抗原蛋白其中一部分以有效的比例结合到泛肽上,进一步结合泛肽,呈递到蛋白酶,降解为多肽,通过抗原肽转运结构(TAP)运送到内质网腔,与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子以亲和吸附方式形成聚合体,多肽MHC-I类分子聚合体通过内质网进入高尔基体,最终到达细胞膜的表面,诱发CD8+细胞毒性T细胞应答的产生1102。第二是另一部分蛋白抗原从分泌它们的APCs的细胞膜上进入MHC-II类型途径,进入MHC-II类呈递途径的蛋白在溶酶体中水解,产生大约20~25个氨基酸的多肽,这些溶酶体和包含MHC-Ò分子的囊泡融合,MHC-Ò分子结合合适的多肽形成MHC异聚体,成熟的MHC异聚体在细胞膜表面和CD4+T细胞反应,引发体液免疫应答11,102。第三也有一部分抗原多肽递呈给B细胞,使B细胞自身活化,产生特异性抗体,诱发体液免疫。另外递呈后的CD4+限制性T细胞(Th)活化、增殖可产生多种细胞因子,进一步促进和强化体液免疫和细胞免疫。核酸免疫后,还可以使肌细胞和抗原递呈细胞被感染,从而使CD4+和CD8+细胞亚群活化,产生特异的免疫应答。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达,但现在的研究表明,只要有外源抗原的存在,也能有效地引起I类MHC限制的CTI。

11,72

应答。胞内型的蛋白分子在与MHCl类分子结合后,是诱导细胞免疫的最好抗原形式1112。5 DNA疫苗的优缺点

DNA疫苗作为第三代疫苗,能刺激机体产生较全面的免疫反应,持续时间长,和灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗相比,具有如下明显的优势:¹在宿主体内表达的过程与自然感染相似,可诱导机体产生全面的免疫应答,抗原性强,并且不存在体外合成蛋白抗原普遍存在的抗原表位的改变或丢失情况,交叉保护作用好。º具有免疫原的单一性,只有编码所需抗原的基因被导入细胞得到表达,避免了载体病毒所携带的大量抗原信息,减少了抗体免疫系统的无效应答,从而增强了特异性免疫应答。»既能诱导体液免疫,也能诱导强烈的细胞免疫。¼核

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以科学发展观为指导,紧紧抓住国家扶持现代农业发展和支持青海等省藏区经济社会发展的历史机遇,依托青海省的资源优势,大力推广蜜蜂优良品种、健康养殖技术、依靠科技进步和不断提高劳动者的素质,并通过政府引导,龙头企业引领和参与,依托养殖小区和规模化养殖场把蜂农户组织起来,实行标准化生产、规范化管理,并由龙头企业统一购销,把资源优势、环境优势尽快转化为经济优势,为农业增效,农民持续增收开辟新的途径、创建规模化经营新模式,推动青海蜂产业持续、快速、健康发展142。3.2 发展思路3.2.1 选育优良蜜蜂品种,充分利用各种蜜源。贵德县/藏蜜牌0蜂蜜的质量达到或优于国际蜂蜜质量标准和国家标准。该种蜜蜂蜂群所生产蜂王浆中,A-葵烯酸含量明显高于国家标准。蜂种可以在贵德县/三河0(河东、河西、河阴)地区及黄河贵德段以下河谷地区安全越冬,为该品种的推广应用创造了条件。3.2.2 大力推广普及蜜蜂健康养殖技术和生物蜂药应用技术,以及清洁加工技术,生产绿色、无公害蜂产品,大幅提升蜂产品的质量。3.2.3 培育蜂产品精深加工龙头企业,发展养蜂业专业生产合作组织,依托养殖小区和规模化养蜂场,实现养蜂业的规模化经营和标准化生产,创建/公司+基地+合作社+农户0的产业化经营新模式,实现公司、合作社、农户合作、互惠互利,共同发展。3.2.4 大力培训养蜂农民,发展规模养蜂户,培育青海东部农业区的养蜂农户群体(或蜜蜂养殖小区),充分利用蜜源植物资源,建设青海省当地的蜂产品原料基地。3.3 主要发展目标3.3.1 特色优质蜂蜜产量发展目标,通过蜂产业振兴计划的实施,2015年使全省蜂蜜产量达到2000t以上。3.3.2 养蜂场建设目标,通过技术培训、养蜂小区建设和规模化养蜂场的建设,发展2万群优良蜜蜂蜂群(建设千群养蜂场

2010年第40卷第4期(总第208期)

10个,百群养蜂小区100个)。

3.3.3 建设2~3个蜂产品加工和营销为一体的龙头企业,对青海所产的蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆、蜂胶、蜂蛹等原料产品进行深度加工和综合利用,生产特色优质蜂产品及制品,实现养蜂户与市场的链接。4 对策和建议

4.1 抓住国家实施西部大开发战略和支持青海等省藏区经济社会发展的大好机遇,依托优势资源,大力普及、推广养蜂技术及采收技术,大力培养青海省东部农业区的养蜂专业户和蜂群管理技术人员,尽快建立起青海本地的养蜂专业户队伍,为蜂产业的发展提供人力资源支持。

4.2 采取政府引导,农业技术服务部门参与,由龙头企业申请项目,发展养蜂业社会化服务体系,加强公益性、经营性服务功能,建设为养蜂农户提供产前、产中、产后的全程服务体系,不断提高养蜂业的技术和管理水平。

4.3 积极组建养蜂专业生产合作社组织,不断提高养蜂农户的组织化程度,为标准化生产,规范化管理和规模化经营创造条件。

4.4 制定优惠、扶持政策,培育蜂产品加工企业,促进龙头企业发展和壮大,增强其综合实力和市场竞争力,不断提高龙头企业自主创新能力和技术服务功能,不断提高其带动、示范作用。

参考文献

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酸疫苗中不涉及致病的核酸序列,因而蛋白质抗原在宿主动物

细胞内表达无毒力回升的危险。½可用于含有母源抗体的婴儿和幼畜,其载体不会被母源抗体所识别,能进行正常表达和诱导免疫反应。¾没有减毒或灭活疫苗的潜在致病危险以及亚单位疫苗免疫反应的不完全性。¿可采取多种途径接种。

DNA疫苗也存在一定缺陷,如要应用于临床,其安全性十分重要,也是首先要考虑的问题。DNA疫苗的导入有可能致癌。外源基因导入后,有可能激活内源性原癌基因,或者使宿主抗癌基因失活,这一可能性不应忽视。目前检查的1800余种核酸疫苗中,虽然没有发现外源基因与宿主染色体整合的证据,但核酸疫苗在真正应用于人和动物体之前,这个问题必须加以解决,若核酸疫苗DNA与宿主染色体发生整合,可能会发生难以预料的严重后果,产生抗DNA抗体。从理论上讲,外来抗原表达的时间越长,产生不良后果的可能性越大,可能诱导机体产生超免反应,最终导致机体免疫抑制而易感染其他病原体1122。

综上所述,越来越多的研究成果已经显示,DNA疫苗在预防和治疗方面具有很大的潜力和优势。参考文献

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