简明使用手册
DATA COLLECTION V3.0 美国应用生物系统公司中国公司
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仪器准备需要空间定否 是 进行空间定位需要光谱校否 是 进行光谱校正运行测序样否 是 编制测序样品板文件运行片断 是 编制片断分析样品板文上机运行P29 结果分析，参考相关
一．DNA 测序或片段分析的流程：
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1.样品制备： 样品制备即是在DNA片断上用化学的方法标记荧光素。 标记上荧光素后就可以对DNA片断进行检测和确认了，一般每一 DNA分子标记一个荧光素分子，最多有五种荧光素可用于DNA样品的标记。 不同的样品制备方法选用不同的荧光素和试剂的组合，样品制备可在96孔或384孔板进行 2.软件设置：
操作人员根据所使用的标记方法、电泳的毛细管长度、电泳胶的种类等，在数据采集(Data Collection)软件中选择正确的运行模块和分析模块。 3.开始运行：
操作人员把样品板放到仪器上并开始运行，仪器便会根据设定好的顺序，用相应的电泳程序分析样品板上的样品。 4.电泳：
用“电进样”的方法将带电的样品分子加到灌好电泳胶的毛细管的进样端（负极）， 然后在毛细管两端加上直流电压，样品中不同大小的DNA片段开始从负极向
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正极移动， 移动的速度受到片段自身大小影响，片断越短移动得越快。电泳的结果是使长度不同的 带电 DNA 片断互相分离，并且按片段的长短的顺序通过检测窗口，产生信号，短片段先到达检测窗口。 5.激发和检测：
当标记有荧光素的DNA片断移动到检测窗口时，荧光素受到激光束的激发而产生荧光信号，此荧光信号被CCD检测器所检测并被转化为电信号传递到计算机。
6.数据采集和处理：
CCD检测器把检测到的荧光信号转换为电信号，并把它传送给安装了Data Collection软件的计算机工站。工作站接收到信号后，用预先设置好的方式进行初步处理，并把这些数据存贮在计算机的数据库里。 7.自动数据提取和分析：
接着，工作站会自动地从数据库中提取这些数据，并根据不同的运行模
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式，完成对样品DNA的碱基序列或片断信息的分析，然后把分析完成后的结果数据以样品文件的形式保存于计算机的硬盘中。 8.结果：
分析好的样品文件可以用序列分析软件或片断分析软件来打开查看结果，如有必要，这些数据可以改用不同的分析参数进行重新分析。 电泳信号图的X轴表示时间，Y轴表示相对荧光强度，图上不同颜色的信号线代表了样品制备时所使用的不同的荧光素（对于测序结果，每种颜色代表一种碱基），图中的每个峰代表一个DNA片断。
测序样品的结果图 片断分析的结果图
二．仪器硬件结构： 1.仪器前视图：
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胶泵（PDP）
泵
胶块
连接管 .
下胶块
胶
管
胶
瓶
阳极缓冲液杯
2.各部件功能：
电源开关：打开或关闭仪器电源；
照明灯开关：打开或关闭仪器内部的照明灯；
阳极缓冲液杯：内装1X缓冲液，电泳时作为阳极介质； Buffer杯：装1X缓冲液，电泳时作为阴极介质； 水杯：装去离子水，清洗毛细管用或放废胶； 泵胶块：泵入胶并将其灌入毛细管；
下胶块：上装有阳极，阳极缓冲液杯装在此处；
恒温加热炉：保证电泳时，毛细管处于一个均一、稳定的温度环境中；
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3.仪器后视图：
注意：请保持激光冷却风扇的出口通畅！ 三．实验操作： 1.仪器准备：
开机：开机的顺序一定是先开电脑再开仪器。
开启UPS电源，确保UPS处于电池供电状态，稳定5分钟； 打开显示器和电脑的电源开关，登录到WIN XP桌面； 检查确保仪器的加热炉门和仪器左右前门；
打开仪器电源开关，仪器进行一系列的初始化后，绿色状态灯亮，仪器启动完成。
仪器的状态指示灯的不同状态显示了仪器处于不同的工作状态，具体请参考下表： 状态 指示灯 操作 仪器已就绪 继续实验 关门状态下进行绿灯长亮 向导 操作 程序运行中 绿灯闪烁 仪器与电脑无法联机 确认已进入WIN XP界面 黄灯长亮 确认网线连接正确 确认前门关闭 第 7 页
仪器下载 确认前门，加热炉门已关闭 firmware 黄灯闪烁 仪器自检 加热炉门打开 前门打开 开门状态下进行向导 操作 故障 关机后等待30秒后开机 红灯长亮 若上一步无效则打开DC3.0软件，进入以 下界面 GA Instruments > ga3130 > instrument name > Instrument Status > Event Log. 查看日志中最后一条信息， 根据相应错误代码来解决问题 若依然无法解决问题，联系ABI工程师 打开Data Collection3.0软件：
选择Start> Programs >Applied Biosystems >Data Collection >Run
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Data Collection v3.0. 或双击桌面快捷方式。
等待Service Console窗口中的指示灯全部变成绿色后，DC软件的界面打开，过程如下：
冲洗Water Seal：
1、 在20ml的注射器里装上20ml去离
子水（水温40ºC以下），将注射器装到右图中2号的位置；
2、 将1号和2号位上的螺母都放松
1/2圈；
3、 用烧杯在1号口底下接收流出来
的水，然后慢慢地压注射器，使水通过Water Seal后从1号口流
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出，要求使用水的体积在10ml以上；
4、 拧紧2号位上的螺母，再拧紧2号
位上的螺母；
5、 取下20ml注射器，冲洗步骤完成。
安装毛细管：
在DC软件中，选择 GA
Instruments>ga3130>
instrument name>.
在工具栏中，选择 Wizards>
Install Array Wizard.
按照向导提示操作 安装好毛细管以后运行毛细管空间定位程序spatial calibration
注意：
不要拉扯毛细管
使用原包装来储存使用过的毛细管，其末端分别放
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在缓冲液槽和小玻璃瓶中
安装毛细管时要戴无粉手套
更换新的胶：
在DC软件中，选择GA Instruments > ga3130 >
instrument name >.
在工具栏中，选择Wizards,然后选择Replenish Polymer Wizard进行同种类型的胶的更换，选择Change Polymer Type Wizard进行不同类型的胶的更换。
按照向导提示操作
注意：
每天都要检查胶块和连接管中有无气泡； 确保有足够量的胶－每轮消耗约50-80ul； 每星期都要更换胶；
使用过期的胶可能会影响数据质量； 请戴无粉手套操作。
准备缓冲液：
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把5ml 10X缓冲液与45ml MilliQ水混合成1X缓冲液；
按下Tray按钮，待自动进样器停止移动后开门；
取下缓冲液槽，水槽和废液槽，拆开并用水清洗；
晾干，在各槽中加入相应的溶液；
擦干各槽后将其放回仪器相应的位置上；
取下阳极缓冲液杯，倒空后先用水淋洗再用1X缓冲液洗；
加入缓冲液；
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将阳极缓冲液杯装回原处。
注意：
溶液槽组装好后，请仔细检查，橡胶垫是否平整；
1X缓冲液在2～8度可放置1个月，室温可放置1星期；
请每24小时更换仪器上在使用的缓冲液； 如果有胶冲入阳极缓冲液杯中请更换缓冲液。
2.毛细管空间定位 ( Spatial Calibration ): 什么是毛细管空间定位？
毛细管空间定位程序把每道毛细管的荧光信号落在CCD上的位置标记出来，从而使DC软件能够找到这些信号。 何时作毛细管空间定位？
1． 安装新毛细管或用过的毛细管后； 2． 移除或调节了毛细管检测窗口的位置； 3． 移动仪器后。
如何作毛细管空间定位？
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选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Spatial Run
Scheduler.
若毛细管中充满了新胶，选择Protocol> SpatialNoFill_1， 否则选择 Protocol> SpatialFill_1
点击Start按钮
评估定位结果，各道的信号高度应该相差不大，间隔13至16之间，确认所有毛细管都有信号，如图：
若接受定位结果，按Accept按钮，否则按 Reject按钮
若空间定位失败
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重复以上过程进行定位
若无效，观察系统中有无气泡，去除气泡后再进行空间定位 若无效，重新安装毛细管的检测窗口，进行空间定位
若无效，取下毛细管，用枪吸取无水甲醇冲洗毛细管检测窗口上的凹槽，如图
待甲醇晾干后将毛细管装回，进行空间定位
检测窗口的前表面
若无效，更换毛细管
3.光谱校正（spectral calibration）： 什么是光谱校正？
从下图可以看到，四（或五）色荧光检测系统的本质是检测四（或五）种荧光素在其中心发射波长处的信号。由于每一种荧光素的发射光谱不是锐线光谱，而是 一种有一定宽度分布的光谱带。所以一个纯荧光除在它自己光谱的中心波长处能采 集到信号N1外，在其他荧光信号光谱的中心波长处亦能检测到信号而产生信号重叠。为了校准信号重叠，需知道一种荧光信号在其他荧光信号处产生的重叠系数。 所以，我们用四（或五）条不同长度的ＤＮＡ片断分别标记上不同的荧光素来计算这些系数。最后得到一个４ｘ４（或５ｘ５）的数据矩阵。 何时作光谱校正？
使用新的荧光染料
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激光或CCD被调节或更换后
不同颜色的荧光间出现干扰（有拔起或下压峰） 参数的改变（荧光类型，毛细管类型和毛细管长度）
如何作光谱校正？ 两种类型的校正标准样品 样品准备
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按照试剂盒说明书
用Hi-Di甲
酰胺混合校正标准样品
震荡离心
95度变性5分钟后立即冰浴2分钟
震荡离心
在样品板中加入样品（96孔板加10ul，384孔板加5ul）
用橡胶垫装配样品板，装配后橡胶垫必须平整，样品板上的孔与橡胶
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橡胶垫未对齐样品
孔
橡胶垫未对齐样品
孔
橡胶垫未对齐样品孔
橡胶垫对齐了样品孔
短甩离心，<1500g X 5s
确认所有孔的样品都在底部,如右图
按下图组装样品板
注意！固定器与橡胶垫的孔一
定要对齐， 否则会损毁毛细管！！
创建光谱校正用的protocol
样品在底部
样品板固定器
橡胶垫 样品板 样品板基座
组装好的样品板
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固定器与橡胶垫的孔
没有对齐
选择GA Instruments > ga3130 >Protocol Manager.
在Instruments Protocols界面中点击New按钮
在Name中为Protocol命名
在Type下拉菜单中选择Spectral
依次选择正确的DyeSet、Polymer、Array Length、 Chemistry和Run Module，点击OK。
创建光谱校正板
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选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Plate Manager.
点击New按钮，在弹出窗口中分别输入以下信息
样品板名字
可选项：样品板的相关描述
选择Spectral Calibration 选择96-well
输入所有者的名字 输入操作者的名字
点击OK按钮
在Spectral Calibration Plate Editor dialog界面中，输入以下信息
样品名 相关信息 前面创建的
Protocol
点击OK按钮，则一个样品板记录创建完成
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运行光谱校正板：
选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Run Scheduler. 将样品板放到自动进样器上，注意板的方向，此时RunScheduler界面中板的指示块由灰色变为黄色
点击FindAll按钮，找到光谱校正的样品板的文件名
点击该文件名后，再点击黄色的板的指示块，此时，指示块将右黄色变为绿色
在DC软件的工具栏中，点击，在随后的对话框中点击OK来开始运行
确认光谱校正成功/失败状态
选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Instrument Status > Event Log.
查看各道毛细管的状态,如下图 相关标准
毛细管位置 是否成功 Q值 Condition number 查看光谱校正结果
选择GA Instruments > ga3130 > instrument name > Spectral Viewer. 在Dye Set下拉菜单中，选择相应的荧光染料 在样品板图上选择某个孔来查看其光谱校正结果 Dye Set Z Dye Set E DS-33(G5)
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故障排除 症状 可能原因 无信号 样品预处理 问题 样品板中有 气泡 光谱校正失败或显示“No candidate 毛细管spectral files found” 阻塞 手工命令灌胶，观察毛细管在阴极的喷胶情况来判断其是否阻塞 毛细管未充 满胶 过期的光谱 校正样品 有很多杂峰 胶过期 更换新胶 检查保质期和储存条件，必要的话更换新批号的样品 检查是否有毛细管断裂，重新灌胶 离心 更换样品，使用新的HI-DI甲酰氨 解决方法 第 22 页
气泡，尤 使用Bubble Remove其在胶中 向导灌胶 使用前要使胶升温至室温 更换过期的胶 胶污染 4.设置DNA测序程序 创建Instrument Protocol
更换新胶 选择GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager.
在Instrument Protocol界面中，点击New按钮
填写弹出的Protocol Editor窗口
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名字
描述
选择REGULAR
按照下表的内容选择相应的Module
按照下表的内容选择相应的Dye Set
Run Module Dye Set
点击OK按钮
创建Analysis Protocol
选择GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager.
在Analasis Protocol界面中，点击New按钮
选择Sequencing Analysis，点击OK按钮
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填写General菜单
名字和描述
按下表选择相应的序列文件格式
文件格式选项 Write .Seq File 含义 .seq文件用文本文件格式来打印序列或用在其它软件中 ABI格式用于Applied Biosystems软件 FASTA格式用于其它软件 Write Standard Chromatogram Format file (.scf) Write Phred (.phd.1) File 创建.scf文件用于其它软件 当KB basecaller同时被使用时，创建.phd.q文第 25 页
件来用于其它软件
填写Basecalling菜单
选择合适的basecaller和DyeSet Primer
如果愿意，可以选择分析的中止点
选择Quality
Threshold选项
选择True或Flat Profile
Processed Data选项 功能 使用同一的标准来处理显示数据，使得其最强区域的峰高为一固定值。处理后的图谱与原始图谱类似。 第 26 页
不同的区域不同处 理，使得中间区域（>约40碱基）的峰高相平 注意：只能在使用KB basecaller分析时使用，若使用ABI basecaller必须用True Profile Quality Threshold选项 功能 使用KB basecaller时，每个位置都要分配一个碱基和相应的QV值 使用KB basecaller时，低于设定的QV值的位置标记Ns，依然会显示其QV值
填写Mixed Baeses菜单（只有在使用KB Basecaller选项时才能激活该菜单）
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选择Use Mixed Base Identification选项
设置相应的检测域值（默认为25%，不能低于15%）
在Clear Range菜单中，选择相应方法 点击OK按钮保存
设置 Result Group，具体如下，设置完成后，点击 OK
选择GA Instruments > Results Group.
点击New按钮创建新Result Group或Edit按钮编辑已有的Result Group
填写General界面
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填写名字 填写所有者（可选） 填写描述（可选）
填写Analysis界面
分析类型中选择Sequencing Analysis
选择是否需要程序结束后自动分析
填写Destination界面（若想使用默认文件夹位置则跳过以下内容）
点击Use Custom Location选择框自定义 文件夹位置
点击Browse按钮来浏览文
件夹位置
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点击Test按钮来测试选择的文件夹位置是 否成功
在Naming界面中按自己的习惯定义命名规则
创建序列分析样品板记录
选择GA Instruments > ga3130 >Plate Manager.
点击New按钮
在弹出的New Plate Dialog窗口中填写以下内容
样品板名字
样品板描述（可选）
选择相应的测序程序
选择96孔板
输入所有者和操作者的名字
点击OK按钮
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在弹出的Sequencing Analysis Plate Editor窗口中，填入相关内容
在Sample Name栏中填入样品名
在Comments栏中填入相关描述
在Results Group 1栏中选择上面创建的Result Group
在Instrument Protocol 1栏中选择上面创建的Instrument Protocol
在Analysis Protocol 1栏中选择上面创建的Analysis Protocol
使用Fill Down功能来完成有相同设置的样品填写
若想让样品运行一轮以上，选择Edit > Add Sample Run并填写相关信息
点击OK按钮
5.设置片段分析程序 创建Instrument Protocol
选择GA Instruments> ga3130 > Protocol Manager. 在Instrument Protocol界面中，点击New按钮
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填写弹出的Protocol Editor窗口
名字
描述
选择REGULAR
选择GeneMapper36_POP7 选择G5
点击OK按钮
Run Modules: DyeSet:
设置Results Group，参考第24页，只需将分析类型改为GeneMapper。 创建片段分析样品板记录
选择GA Instruments > ga3730 >Plate Manager.点击New按钮 在弹出的New Plate Dialog窗口中填写以下内容
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样品板名字
样品板描述（可选）
选择相应的GeneMapper程序 选择96孔板
输入所有者和操作者的名字
点击OK按钮
在弹出的GeneMapper Plate Editor界面中，填写以下信息
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
在Sample Name栏中，输入样品名 在Comment栏中，输入相关描述 在Sample Type栏中，选择样品类型 在Size Standard栏中，选择合适的内标 在Panel栏中，选择合适的panel
在Analysis Method栏中，选择合适的分析方法 在Snp Set栏中，选择合适的SNP 输入相关的用户自定义信息
在Result Group 1栏中，选择合适的Result Group
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10. 在Instrument Protocol 1栏中，选择上面创建的protocol
使用Fill Down功能来完成有相同设置的样品填写
若想让样品运行一轮以上，选择Edit > Add Sample Run并填写相关信息
点击OK按钮
6.运行程序
选择GA Instruments > ga3130 >instrument name > Run Scheduler. 将样品板放到自动进样器上，注意板的方向，此时RunScheduler界面中板的指示块由灰色变为黄色
点击FindAll按钮，找到样品板的文件名
点击该文件名后，再点击黄色的板的指示块，此时，指示块将右黄色变为绿色
在DC软件的工具栏中，点击，在随后的对话框中点击OK来开始运行。
测序程序运行时间 片段分析程序运行时间： 运行过程的控制：
点击 作用 开始运行 立即停止运行 在当前样品运行完成之后，停止运行 跳过当前的Run，运第 34 页
行下一个样品 暂停当前运行的样品 四．日常维护
每天 维护工作 确认溶液槽中有足够的缓冲液和水 确认样品板被正确组装 重要！固定器和橡胶垫的孔必须对齐，否则会损毁毛细管 确认样品板牢靠平整地固定在托架上 重要！永远不要使用弯曲的样品板 检查阳极缓冲液杯中缓冲液的量，确认其溢液孔畅通且每次实验前 面朝仪器前方 更换溶液槽中的缓冲液和水，确认槽的外围是干燥的 每24小时 每次实验前 频率 每次实验前 每次实验前 检查泵胶块，下胶块，连接管，胶管和各通道中的气泡，每天或每次实验使用Bubble Remove向导去除气泡 检查毛细管的取样末端以确认其未损坏 前 每天或每次实验前 检查胶瓶中的胶以确认有足够的胶完成实验 每天或每次实验第 35 页
前 检查泵胶块和下胶块以确认其未松动 清洁仪器表面 检查毛细管旋纽，连接管螺帽和阀门以防止泄漏 每星期 维护工作 使用Replenish Polymer wizard向导换胶 检查旧毛细管的储存条件 冲洗水密封环 每月 维护工作 运行Water Wash向导，不管有无气泡，冲洗毛细管端口 需要时 维护任务 清洁漏液托盘 更换毛细管 去除毛细管末端已经干掉的胶，使用双蒸水润湿的无纤维布 每天 每天 每天 频率 每星期或需要时 每星期 每星期或需要时 频率 每月或需要时 频率 需要时 需要时 需要时 希望以上资料对你有所帮助，附励志名言3条：
1、要接受自己行动所带来的责任而非自己成就所带来的荣耀。
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2、每个人都必须发展两种重要的能力适应改变与动荡的能力以及为长期目标延缓享乐的能力。
3、将一付好牌打好没有什么了不起能将一付坏牌打好的人才值得钦佩。
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