文献综述 - 酵母双杂交法筛选与鉴定黑麦草衰老因子

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酵母双杂交法筛选与鉴定黑麦草衰老因子 LpSGR的互作蛋白 彭 青 青 草业学院 草业科学 草业121 15512122

指导教师: 徐彬 职称: 副教授

2015年 6 月 26日

南京农业大学教务处制

酵母双杂交法筛选与鉴定黑麦草衰老因子LpSGR的互作蛋白

作者：彭青青 指导教师：徐彬

摘要：饲草收获后叶绿素降解加速，蛋白质流失，饲草品质下降。阻抑叶绿素降解能够延长饲草采后绿期，提高蛋白质含量，提高饲草品质。禾草的叶片衰老受多种外源信号和内源生长发育进展影响，例如外源施用细胞分裂素或内源调解细胞分裂素合成都能够有效延缓。经实验研究发现，叶片衰老相关基因SGR的表达也同样受到自身发育阶段和外源物质的影响，例如外源施加细胞分裂素能够抑制SGR基因的表达。本实验将对黑麦草衰老因子LpSGR的互作蛋白进行鉴定和筛选，进一步了解SGR参与的衰老机理调控网络，挖掘参与叶片衰老的遗传调控因子，为对饲草育种提供理论基础。 关键词：多年生黑麦草；衰老；酵母双杂交； LpSGR；互作蛋白

Screening and Identification of Interacting Proteins of the senescence factor LpSGR of Perennial Ryegrass’s through the Yeast Two Hybrid

System

Name: QingQing Peng Advisor: Bin Xu

Abstract：After forage harvest, the accelerated chlorophyll degradation and protein loss lead to declined forage quality decline. Blocking the chlorophyll degradation can extend the green period of the forage grass and increase the protein content, which can eventually improve the quality of the forage grass. The leaf senescence period of the grass can be delayed effectively due to many endogenous and exogenous factors, e.g. the application of cytokinins or increase of endogenous cytokinins levels can effectively delay the senescence process. Similarly, the senescence genetic factor, LpSGR is transcriptionally regulated by leaf senescence factors, either endogenous and exogenous, e.g. exogenous application of ctyokinins can inhibit the expression of LpSGR. In this study, the potential interactors of the LpSGR protein will be screened using the yeast two hybrid system. The expected result will lay a foundation for the understanding of the regulatory network underlying leaf senescence and excavate genes directly or indirectly regulating leaf senescence process, which knowledge will ultimately benefit the molecular breeding of forage grass.

Key words: Perennial ryegrass；Senescence；Yeast two-hybrid system；LpSGR； Interactor

前言

随着我国农业产业结构的调整、国家对畜牧业发展的大力支持以及人民生活水平的提高，畜牧业产品在人们的生活中占据着越来越重要的地位，农区和牧区对饲草产品的需求和要求也日益增高。在生产上，收获后的饲草叶片叶绿素降解加速导致蛋白质降解流失，降低饲用干草的营养价值。对于大多数饲草，其产品器官形成的关键时期，叶片衰老引起光合作用减退，将极大程度地限制了作物产量潜力的发挥；同时，青绿色又是优质饲用干草的重要外观特征和评价标准，因此，延缓饲草的衰老具有重要的理论和实践意义。 多年生黑麦草（Lolium perenne L.），禾本科早熟禾亚科黑麦草属（Lolium L.）植物，属冷季型草，是重要的牧草和草坪草[1]，主要分布于温带湿润地区，我国南方、华北、西南地区都有大面积的种植和利用。与其他冷季型禾本科牧草相比，多年生黑麦草多为二倍体[2]，基因组测序已经开展[3]，遗传转化体系成熟[4]，因此，多年生黑麦草是研究叶片衰老

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的理想冷季型草。研究多年生黑麦草叶片衰老机制，将为饲草育种提供理论基础。

正文

1、植物叶片衰老的特征与机理

植物的叶片衰老是一种程序性死亡，同时受到内部基因的表达调控和外部环境的影响。叶片衰老明显的外观标志是植物叶色由绿变黄直到脱落，而在细胞水平上表现为叶绿体的解体、叶绿素含量下降、蛋白质等多种内容物的释放、光合磷酸化能力降低、细胞分裂素（CTK）含量下降、脱落酸（ABA）含量上升等。叶片衰老预示着植物光合系统的破坏和同化能力的丧失。叶片衰老伴随着植物内源激素水平的变化，呼吸作用、气孔的开合及核孔的变化。

2、细胞分裂素能够有效延缓叶片衰老

在饲草收获和加工过程中，人们会采用一些人工方法或者利用自然条件加速饲草干燥，使得细胞快速脱水死亡以避免叶绿素和蛋白质等养分的降解。同时，科学家也在尝试通过生物育种学手段选育出延缓饲草衰老的品种，例如通过抑制STAY-GREEN基因（SGR）的表达，不但可以使衰老叶片或收获后的叶片长期保持绿色，收获后的蛋白含量也高于野生型[5]。

外源施加细胞分裂素(CTK)可以有效地延缓植物叶片的衰老。例如，在绿叶蔬菜上用细胞分裂素可以起到保绿防衰、延长蔬菜贮藏的作用，已在实践中得到广泛应用。Singh等(1992)证明，在所有植物激素中，外施CTK对烟草叶片延衰作用效果最好；内源调控CTK相关基因表达也能够有效延缓植物叶片衰老。例如，在叶片中过量表达细胞分裂素合成途径的关键基因-异戊烯基转移酶（IPT）基因，可以显著延缓转基因植株的衰老[6] ，[7]。在禾草植物高羊茅[8]和匍匐剪股颖[7]中利用衰老特异启动子表达IPT基因都不仅显著延缓了叶片衰老，而且提高了植株的抗热、抗寒、抗旱等能力。 3、细胞分裂素能够有效抑制叶片衰老相关基因SGR的表达

叶片衰老过程伴随着叶绿素的降解，而SGR是叶绿素降解途径的核心蛋白，在转录水平上受衰老信号调控，活体过量表达SGR基因能够诱导叶绿素降解[9]。基因的转录水平调控是生物维持正常生理水平的重要调控模式。在不同物种中，SGR与叶绿素降解酶编码基因表达量均伴随叶片衰老过程而上升[5]。实验发现，在黑麦草叶片衰老进程中，LpSGR基因的表达量上升1000倍左右 ，而在施用外源CTK的情况下，LpSGR基因表达水平受到显著抑制。因此，可以推断LpSGR基因的转录调控是黑麦草叶片衰老进程中叶绿素降解的关键调控步骤，而该步骤受到CTK的抑制。 4、筛选互作蛋白的目的

在衰老叶片中，SGR作为核心蛋白聚合形成的蛋白复合体，协调控制叶绿素的降解，是叶绿素降解途径的核心调控蛋白（“master” regulator）[5]。目前对叶片衰老过程中SGR的表达调控机理尚无报道，将黑麦草衰老因子LpSGR的互作蛋白加以鉴定和筛选出来， 将有助于阐明黑麦草叶片衰老的调控机理。 5、酵母双杂交法如何筛选、鉴定互作蛋白

酵母双杂交系统是筛选互作蛋白的重要方法。该方法将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和GAL4

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激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。 酵母双杂交系统是建立在对真核转录激活因子认识的基础上，真核转录激活因子包括两个功能结构域：一个是与上游激活序列（Upstream activiating sequence）结合d DNA结合结构域（DNA-binding domain, BD）；另一个是DNA激活结构域（DNA Activation domain, AD）。 将目的蛋白的基因转入带有BD结构域的质粒载体中，把其转入酵母细胞中表达一个融合入蛋白-诱饵蛋白（Bait）；把要筛选的cDNA文库中所有基因片段克隆至带有AD结构域的另一质粒载体中，表达另一个杂交蛋白-靶蛋白（Prey）。然后共转化酵母菌或是通过两个单倍体酵母菌融合，在选择性缺陷培养基上筛选，通过对报告基因型的鉴定来确定两个蛋白是否存在相互作用。

6、酵母双杂交法筛选和鉴定互作蛋白的重要性

酵母双杂交的建立是得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DB和AD（见4），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点①易于转化、便于回收扩增质粒；②具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因；③酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域（如GAL4-bd，LexA-bd）；另一个基因融合到转录激活结构域（如GAL4-ad，VP16）。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达，从而可分析蛋白间的结合作用。

综上，酵母双杂交法具有以下优点：（1）检测在活细胞内进行，是较为成熟的真核系统，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子得到作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官。细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能够分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。此外，其他鉴定和筛选互作蛋白的方法相比酵母双杂交法实验量大、资金需求量大，综合以上因素，酵母双杂交法是筛选互作蛋白的重要手段。 7、酵母双杂交法存在的问题及应对策略

存在的问题：（1）双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。（2）另一个重要问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录

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功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外有些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。

“假阳性”对策：及时根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下几个方面进行分析：（1）这种相互作用是否会在细胞内自然发生，即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。(2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员，它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。（3）一些实际上没有任何作用的但有相同的模体（motif），如两个亲α-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。

结论

综上所述，叶片衰老影响牧草品质和产量的重要因素，叶片衰老进程受到CTK的调控，衰老因子SGR在表达水平同样受到CTK的负向调控。目前，CTK调控叶片衰老过程的分子机理仅见于拟南芥等模式植物和重要粮食作物中，牧草中尚无此类报道；另外，CTK如何调控叶绿素含量的机理尚不清楚。因此，本项目对黑麦草衰老因子LpSGR的互作蛋白的筛选和鉴定，不仅有助于阐明黑麦草叶片衰老的调控机理，还有助于挖掘调控黑麦草叶片衰老和叶绿素降解的新基因，为培育新型具有长久持绿特性的植物作出贡献。 参考文献：

[1] Conaghan, P. and M. Casler (2011). \"A theoretical and practical analysis of the optimum breeding system for perennial ryegrass.\" Irish Journal of Agricultural and Food Research: 47-63.

[2] Wang, Y., C. A. Bigelow, et al. (2009). \"Ploidy level and DNA content of perennial ryegrass germplasm as determined by flow cytometry.\" HortScience 44(7): 2049-2052.

[3] Pfeifer, M., M. Martis, et al. (2013). \"The perennial ryegrass GenomeZipper: targeted use of genome resources for comparative grass genomics.\" Plant physiology 161(2): 571-582.

[4] Zhang, W.-J., R. E. Dewey, et al. (2013). \"Enhanced Agrobacterium-mediated transformation efficiencies in monocot cells is associated with attenuated defense responses.\" Plant molecular biology 81(3): 273-286. [5] Kusaba, M., A. Tanaka, et al. (2013). \"Stay-green plants: what do they tell us about the molecular mechanism of leaf senescence.\" Photosynthesis Research: 1-14.

[6] Xu, Y., J. Tian, et al. (2009). \"Effects of SAG12-ipt expression on cytokinin production, growth and senescence of creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.) under heat stress.\" Plant Growth Regulation 57(3): 281-291.

[7] Merewitz, E. B., T. Gianfagna, et al. (2010). \"Effects of SAG12-ipt and HSP18.2-ipt Expression on Cytokinin Production, Root Growth, and Leaf Senescence in Creeping Bentgrass Exposed to Drought Stress.\" Journal of the American Society for Horticultural Science 135(3): 230-239.

[8] Hu, Y., W. Jia, et al. (2005). \"Transgenic tall fescue containing the Agrobacterium tumefaciens ipt gene shows enhanced cold tolerance.\" Plant Cell Rep 23(10-11): 705-709.

[9] Park, S. Y., J. W. Yu, et al. (2007). \"The senescence-induced staygreen protein regulates chlorophyll degradation.\" The Plant Cell 19(5): 1649-1664.

[10]杨晓红，陈晓阳，刘克锋.细胞分裂素对植物衰老的延缓作用[J] .热带亚热带植物学报，2006,14（3）；256-262.

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专业文献综述成绩评阅表

学院 题目 草业学院 专业 草业121 姓名 彭青青 酵母双杂交法筛选与鉴定黑麦草衰老因子LpSGR的互作蛋白 指导教师意见(包括选题是否恰当、文字表达水平、论文的难度和创新性、参考文献质量、格式是否规范等方面，请使用钢笔书写或打印)： ５

论文评定成绩：

指导教师签名： 年 月 日 ６